PROTINA K: MGA KATANGIAN, AKTIBIDAD NG ENZYMATIC, MGA APLIKASYON - BIOLOGY - 2026

Ang K proteinase ay isang enzyme na kabilang sa grupo ng mga serine na mga protease, ibig sabihin, nasa gitna ito ng isang catalytically aktibong amino acid serine at may function ng pagsira ng mga peptide bond sa pamamagitan ng hydrolysis. Sa turn, ang enzyme na ito ay kabilang sa pamilya ng mga protina ng subtilisin (peptidase S8).

Ang Proteinase K ay may bigat na molekular (MW) na 28,900 dalton at nahiwalay sa kauna-unahang pagkakataon noong 1974 sa mga extract ng fungus na Engyodontium album, na dating kilala bilang Tritirachium album Limber.

Molekular na istraktura ng Proteinase K. Pinagmulan: Lykchiniadis

Ito ay may isang mataas na kapasidad ng proteolytic, na ipinakita sa pamamagitan ng pagiging mapanghinawa ang keratin na naroroon sa buhok. Ang salitang keratin sa Ingles ay nabaybay na "keratin", kaya tinawag itong "proteinase K".

Dahil sa mataas na kapangyarihan nito upang mai-clear ang mga katutubong protina, ang enzyme na ito ay kapaki-pakinabang sa iba't ibang mga diskarte sa molekula na biology. Pangunahin itong ginagamit upang ihiwalay at maghanda ng mataas na molekulang timbang (MW) mga nucleic acid.

Gumagana ang Proteinase K sa pamamagitan ng paglabas ng nuclear DNA, habang sinisira ang mga protina at hindi aktibo ang RNases at DNases, iyon ay, tinatanggal ang mga nuklear sa paghahanda ng DNA at RNA.

Sa kabilang banda, nakita na ang proteinase K ay maaaring i-hydrolyze ang ilang mga denatured katutubong protina, na pinukaw ang interes ng mga mananaliksik para sa paggamit nito sa pag-aaral ng mga protina ng prion (PrPC).

Gayunpaman, sa kabila ng kanilang mataas na potensyal na proteolytic, mayroong mga protina na lumalaban sa pagkilos ng proteinase K. Kabilang sa mga ito ang ilang mga hindi normal na protina na tinatawag na prions (PrPSc), na nauugnay sa nakukuha na spongiform encephalopathies.

Mga katangian ng Proteinase K

Ang Proteinase K ay may istrukturang tersiyaryo na binubuo ng tatlong mga patong, na may pitong-chain β sheet na nakakabit sa pagitan ng dalawang layer ng mga helice. Tulad ng pagmamay-ari nito sa S8 pamilya ng mga peptidases, nailalarawan ito sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang catalytic triad sa aktibong site na ito, na ang sunud-sunod na pagkakasunud-sunod ay (Asp, His and Ser), na naiiba ang mga ito mula sa iba pang mga pamilya ng peptidases.

Ang enzyme na ito mula sa pangkat ng mga serine na mga proteases ay nailalarawan sa pamamagitan ng hydrolyzing ang peptide bond na malapit sa carboxylic group ng aliphatic at aromatic amino acid.

Sa kabilang banda, may kakayahang kumilos sa pagkakaroon ng ilang mga kinakaing unti-unting mga sangkap, tulad ng sodium dodecyl sulfate (SDS), Tris-HCL at EDTA, na ginagamit upang matulungan ang denaturation ng mga protina, na nagiging sanhi ng pagkawala ng kanilang katutubong istraktura.

Ito ay isang paunang hakbang sa paghahanda ng mga protina para sa diskarteng electrophoresis. Ang saklaw ng pH kung saan kumikilos ang proteinase K (2.0 hanggang 12.0), na may isang optimal na pH sa pagitan ng 7.5 hanggang 12.0, at ang punto ng isoelectric ay 8.9. Tulad ng nakikita, aktibo ito laban sa isang malawak na saklaw ng pH.

Ang isa pang katangian na nakatayo sa proteinase K ay ang katatagan nito sa pagkakaroon ng mataas na temperatura (50 - 60 ° C).

Aktibidad ng enzimiko

Ang Proteinase K ay nangangailangan ng pagkakaroon ng calcium calcium, kahit na hindi ito nakakaapekto sa aktibidad nito, kung ito ay mahalaga upang mapanatili ang katatagan nito.

Para sa proteinase K na ganap na matunaw ang substrate, kinakailangan ang isang oras ng contact na humigit-kumulang 5 minuto hanggang 2 oras.

Gayunpaman, sa kahulugan na ito, inihambing ni Daza et al. Ang kadalisayan ng DNA na nakuha sa iba't ibang oras ng pagkakalantad laban sa proteinase K, at napagpasyahan na ang isang matagal na pagpapapisa ng itlog (hanggang 24 h) ay makabuluhang nagpapabuti sa kalidad ng DNA.

Gayunpaman, na may kaugnayan sa konsentrasyon ng protina ng proteinase K na ginamit sa iba't ibang mga protocol, masasabi na iba-iba ito.

Maaari itong magamit mula sa napakababang konsentrasyon (5 µg / ml) hanggang sa mga konsentrasyon na 500 µg / ml. Ngunit ang pinaka-karaniwang konsentrasyon sa pagtatrabaho ay saklaw mula sa 50-100μg / ml, lalo na para sa panunaw ng protina at hindi aktibo ang nuclease. Bagaman para sa paggamot ng mga tisyu ay kinakailangan ang konsentrasyon ng 2 mg / ml.

Aplikasyon

Malawak ang mga aplikasyon nito at maaaring mai-summarize tulad ng sumusunod:

Ito ay ginagamit sa pantunaw ng mga protina at pagkuha ng DNA sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan tulad ng: salting-out, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), binago ang potassium acetate at pagkuha ng sodium iodide.

-Inactivation ng mga nucleases (RNases at DNases).

-Sa pamamaraan ng pag-hybrid ng lugar na ito (HIS), upang matulungan ang pagpapakawala ng nucleic acid, bilang karagdagan sa pag-aalis ng hindi kanais-nais na mga protina.

-Modipikasyon ng mga protina.

-Ang antas ng pananaliksik, sa iba't ibang mga pag-aaral.

Mga kalamangan ng proteinase K

Maraming mga paghahambing na pag-aaral ang isinasagawa sa pagitan ng mga pamamaraan ng pagkuha ng DNA na gumagamit ng Proteinase K, kasama ang iba na hindi gumagamit nito at lahat ay nagtatapos na may higit na mga benepisyo kapag gumagamit ng enzyme. Kabilang sa mga kalamangan ang sumusunod:

-DNA ng mataas na timbang ng molekular, ng mataas na kalidad at kadalisayan ay nakuha.

-Ang nakuha na DNA ay matatag hanggang sa 3 buwan.

Ang nakuha na DNA ay maaaring magamit sa mga sumusunod na pamamaraan: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), electrophoresis, bukod sa iba pa.

Protina ang lumalaban na protina K

Ang iba't ibang mga pagsisiyasat ay nagpasya na ang mga prion (abnormal na nakakalason na protina ng PrPSc) ay naiiba sa mga protina ng PrPC (katutubong) sa pamamagitan ng pagiging lumalaban sa pagkilos ng proteinase K, habang ang mga PrPC ay sensitibo sa pagkilos nito.

Inilarawan ng iba pang mga may-akda na sa istraktura ng PrPSc mayroong mga sensitibong bahagi at ang iba ay lumalaban sa proteinase K. Gayunpaman, ang parehong mga bahagi ay pantay na nakakalason at nakakahawang.

Sa kabilang banda, ang Bastian et al. Noong 1987 ay naghiwalay ng 4 na protina ng 28, 30, 66 at 76 kda mula sa isang species ng Spiroplasma mirum. Natagpuan ang lahat na lumalaban sa pagkilos ng proteinase K at mayroon ding cross-reaksyon na may ilang mga prion.

Alam na ang species na ito ay maaaring maging sanhi ng mga katarata at mahalagang pinsala sa neurological at dahil sa mga natuklasang siyentipiko ng Bastian, bukod sa iba pang mga pagsisiyasat, isang pagtatangka ang nagawa upang maiugnay ang microorganism na ito na maaaring mailipat ang spongiform encephalopathies.

Gayunpaman, ang etiology ng degenerative neurological pathology na ito ay patuloy na maiugnay sa mga prion ngayon.

Sa kahulugan na ito, si Butler et al. Noong 1991 ay nakilala at nailalarawan ang isang klase ng protina na lumalaban sa proteinase K ng 40 kda mula sa dalawang mga strain ng Mycoplasma hyorhinis. Ang pathogen na ito ay nakakaapekto sa mga baboy, na nakakaapekto sa kanilang mga tisyu, ngunit sa kasong ito ay walang cross-reaksyon na sinubukan ang mga prion.

Kinakailangan ang mas maraming pananaliksik upang maiwasang maraming hindi kilalang bagay tungkol dito.

Mga Sanggunian

1. Bastian F, Jennings R, at Gardner W. 1987. Ang antiserum sa scrapie na nauugnay sa fibril protein cross-react sa Spiroplasma miru m fibril protein. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Pagsusuri ng isang paraan ng pagkuha ng DNA at pamamaraan ng paglilinis mula sa formaldehyde-fixed muscle tissue ng hindi nakikilalang mga cadavers. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, At Mcgarrity G. Pagkilala at Katangian ng Proteinase K-Resistant Proteins sa mga Miyembro ng Class Mollicutes. Impeksyon at kaligtasan sa sakit, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Paghahambing ng dalawang Trypanosoma cruzi DNA protocols na lumaki sa axenic medium. Rev. Peru. Kalusugan ng Kalusugan ng Publiko 2014 31 (2): 222-227. Magagamit sa: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E at Palma W. Pagpapasya ng pagiging epektibo ng limang protocol ng pagkuha ng DNA mula sa paraffinized material para sa mga pag-aaral ng molekular. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.