GIEMSA STAIN: MAKATUWIRAN, MATERYALES, PAMAMARAAN AT PAGGAMIT - BIOLOGY - 2025

Ang mantsa ng Giemsa ay isang uri ng pangkulay na mga sample ng klinikal, batay sa halo ng acid at pangunahing mga tina. Ang paglikha nito ay binigyang inspirasyon ng gawa na ginawa ni Romanowsky, kung saan Gustav Giemsa, isang chemist at bacteriologist na nagmula sa Alemanya, pinerpekto ito sa pamamagitan ng pagdaragdag ng gliserol upang patatagin ang mga compound.

Ang mga pagbabago na nabuo sa orihinal na diskarteng Romanowsky na pinahihintulutan na mas mapabuti ang mikroskopikong mga obserbasyon, samakatuwid ang pamamaraan ay nabautismuhan sa pangalan ng Giemsa stain.

Ang iba't ibang mga sample na stain na may mantsa ng Giemsa. A. Trypanosoma evansi sa peripheral blood. B. Mga normal na selula ng dugo. C. Borrelia theileri sa peripheral blood. Ang lymphoma ng D. Burkitt.

Dahil ito ay isang simpleng pamamaraan upang maisagawa, lubos na gumagana at pangkabuhayan, kasalukuyang ginagamit ito sa klinikal na laboratoryo para sa mga hematological smear, mga sample ng utak ng buto at mga seksyon ng tisyu.

Ang diskarte sa paglamlam ng Giemsa ay lubhang kapaki-pakinabang para sa mga pag-aaral ng cytological, dahil pinapayagan nito ang pag-obserba ng mga tiyak na istruktura ng cell. Ang pamamaraan na ito ay naglalaman ng mga cytoplasms, nuclei, nucleoli, vacuoles at granules ng mga cell, na magagawang makilala kahit na ang mga pinong mga bakas ng chromatin.

Bukod dito, ang mga makabuluhang pagbabago sa laki, hugis o kulay ng nucleus ay maaaring makita, kung saan posible na mailarawan ang pagkawala ng ugnayan ng nucleus-cytoplasm.

Sa kabilang banda, pinapayagan nitong kilalanin ang mga immature na cell sa utak ng buto at peripheral blood, na mahalaga para sa pagsusuri ng mga malubhang sakit tulad ng leukemia. Posible ring tuklasin ang mga hemoparasite, sobrang at intracellular bacteria, fungi, bukod sa iba pa.

Sa mga cytogenetics malawak na ginagamit ito, dahil posible na pag-aralan ang mitosis ng mga cell.

Batayan ng Giemsa staining

Ang Romanesky-type na mga tina ay batay sa paggamit ng kaibahan sa pagitan ng acidic at basic dyes, upang makamit ang pag-stain ng mga pangunahing at acid na istruktura ayon sa pagkakabanggit. Tulad ng makikita, mayroong isang pagkakaugnay sa mga acid dyes upang mantsang mga pangunahing istruktura at kabaligtaran.

Ang pangunahing tinain na ginamit ay asul na methylene at ang mga oxidized derivatives (Azure A at Azure B), habang ang acid dye ay eosin.

Ang mga istruktura ng acid ng mga cell ay ang mga nucleic acid, ang mga butil ng mga segment na basophil, bukod sa iba pa, samakatuwid ay mahahawahan ito ng asul na methylene.

Sa parehong kahulugan, ang mga pangunahing istruktura ng mga cell ay hemoglobin at ilang mga butil tulad ng mga nakapaloob sa mga segment na eosinophil, bukod sa iba pa; ito ay marumi sa eosin.

Sa kabilang banda, dahil sa ang katunayan na ang methylene na asul at azure ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagiging metachromatic colorants, maaari silang magbigay ng isang variable hue sa iba't ibang mga istraktura ayon sa pagkarga ng mga polyanion na kanilang natamo.

Ito ay kung paano ang estratehikong kumbinasyon ng mga pangunahing at acid dyes ay namamahala upang makabuo ng isang malawak na spectrum ng mga kulay, ayon sa mga katangian ng biochemical ng bawat istraktura, paglalakad sa maputlang asul, madilim na asul, lilac at lila na kulay sa kaso ng mga istruktura ng acid.

Habang ang kulay na ibinigay ng eosin ay mas matatag, na bumubuo ng mga kulay sa pagitan ng mamula-mula-orange at salmon.

materyales

Mga materyales para sa paghahanda ng solusyon sa stock

Ang paghahanda ng solusyon sa stock ay nangangailangan ng pagtimbang ng 600 mg ng pulbos na mantsa ng Giemsa, na sinusukat ang 500 cc ng acetone-free na methyl alkohol at 50 cc ng neutral na gliserin.

Paano ihanda ang solusyon sa stock

Ilagay ang mabibigat na pulbos na Giemsa sa isang mortar. Kung mayroong mga bukol dapat silang spray. Kasunod nito magdagdag ng isang kapansin-pansin na halaga ng sinusukat na gliserin at ihalo nang mabuti. Ang pinaghalong nakuha ay ibinuhos sa isang malinis na bote ng amber.

Ang natitirang labi ng gliserin ay inilalagay sa mortar. Paghaluin muli upang linisin ang natitirang colorant na natigil sa mga dingding ng mortar at ibuhos sa parehong garapon.

Ang botelya ay nakulong at inilagay sa isang paliguan ng tubig sa 55ºC sa loob ng 2 oras. Habang ito ay nasa isang paliguan ng tubig, malumanay iling ang halo tuwing kalahating oras o higit pa.

Kasunod nito, pinapayagan ang halo na palamig upang ilagay ang alkohol. Noong nakaraan, ang isang bahagi ng sinusukat na alkohol ay inilalagay sa mortar upang matapos na hugasan ang natitirang colorant at pagkatapos ay idinagdag ito sa halo kasama ang natitirang alkohol.

Ang paghahanda na ito ay dapat na iwanan upang magtanda nang hindi bababa sa 2 linggo. Ang ginamit na bahagi ng solusyon sa stock ay dapat na mai-filter.

Upang maiwasan ang kontaminasyon ng paghahanda, inirerekumenda na ilipat ang bahagi na magiging palaging ginagamit sa isang maliit na bote ng amber na may isang dropper. Refill tuwing nauubusan ang reagent.

Mga materyales upang ihanda ang solusyon sa Buffer

Sa kabilang banda, ang isang solusyon sa buffer sa pH 7.2 ay inihanda tulad ng sumusunod:

6.77 g ng sodium phosphate (anhydrous) (NaHPO ₄ ), 2.59 g ng potassium dihydrogen phosphate (KH ₂ PO ₄ ) at ang distilled water ay timbang hanggang sa 1000 cc.

Pangwakas na paghahanda ng colorant

Para sa paghahanda ng pangwakas na solusyon sa paglamlam, ang 2 ml ng na-filter na solusyon sa stock ay sinusukat at halo-halong may 6 ml ng solusyon sa buffer. Gumalaw ng pinaghalong.

Ang isang kaugnay na katotohanan na dapat isaalang-alang ay ang mga pamamaraan ng paghahanda ng pangkulay ay maaaring magbago depende sa komersyal na kumpanya.

Karagdagang mga materyales na kinakailangan upang maisagawa ang pangkulay

Bukod sa mga materyal na inilarawan, dapat kang magkaroon ng mga tulay na pangkulay, t-shirt na may tubig o buffer para sa paghuhugas, mga slide ng object o mga takip para sa mga bagay, isang segundometro upang makontrol ang mga oras ng pangulay at blotting papel o ilang mga materyal na maaaring magamit upang matuyo ( gasa o koton).

Teknik

Proseso ng paglamlam

1) Bago ang paglamlam, ang smear ng sample ay dapat maging handa sa isang malinis na slide.

Ang mga halimbawa ay maaaring dugo, utak ng buto, seksyon ng histological tissue o mga sample ng cervico-vaginal. Inirerekomenda na ang mga pagkalat ay manipis at magkaroon ng 1 o 2 oras na pagpapatayo bago kulayan.

2) Sa isang tulay na pangkulay, ilagay ang lahat ng mga sheet na kailangang kulay. Palagi kang nagtatrabaho sa parehong pagkakasunud-sunod at ang bawat sheet ay mahusay na nakilala.

3) Maglagay ng ilang patak ng 100% methyl alkohol (methanol) sa pahid at pahintulutan itong kumilos nang 3 hanggang 5 minuto, upang ayusin at maligo ang halimbawang.

4) Itapon ang methanol na naroroon sa sheet at hayaang matuyo ang hangin.

5) Sa sandaling tuyo, ilagay ang pangwakas na solusyon sa paglamlam sa isang patak hanggang sa masakop ang buong sheet. Iwanan upang kumilos ng 15 minuto. Inirerekomenda ng ilang mga may-akda ng hanggang sa 25 min. Nakasalalay ito sa bahay ng negosyo.

6) Alisan ng tubig ang mantsa at hugasan ang pahid na may distilled water o may isang 7.2 buffer solution.

7) Sa isang papel na blotting, hayaang matuyo ang mga sheet sa bukas na hangin, naayos nang patayo sa tulong ng isang suporta.

8) Linisin ang likod ng slide na may alkohol na pamunas o pamunas ng koton upang alisin ang anumang mga bakas ng mantsa.

Mga gamit

Ang diskarte sa paglamlam ng Giemsa ay ginagamit sa iba't ibang mga lugar, kabilang ang: hematology, mycology, bacteriology, parasitology, cytology at cytogenetics.

Hematolohiya

Ito ang pinaka madalas na paggamit na ibinigay sa mantsang ito. Sa pamamagitan nito, ang bawat isa sa mga cell na naroroon sa mga buto ng utak o peripheral blood samples ay maaaring matukoy. Pati na rin ang pagtantya ng bilang ng bawat serye, na nakakakita ng leukocytosis o leukopenia, thrombocytopenia, atbp.

Dahil sensitibo ito sa pagkilala sa mga immature cells, may kaugnayan ito sa diagnosis ng talamak o talamak na leukemias. Posible ring gawin ang diagnosis ng anemya, tulad ng sickle cell anemia, sickle cell, bukod sa iba pa.

Mycology

Sa lugar na ito, ang paggamit nito ay karaniwang sa paghahanap para sa Histoplasma capsulatum (intracellular dimorphic fungus) sa mga sample ng tisyu.

Bacteriology

Sa mga hematological smears na may mantika na may Giemsa posible na makita ang Borrelias sp sa mga pasyente na mayroong sakit na tinatawag na paulit-ulit na lagnat. Ang mga spirochetes ay sagana sa mga erythrocytes, sa mga halimbawang kinuha sa rurok ng lagnat.

Posible ring mailarawan ang intracellular bacteria tulad ng Rickettsia sp at Chlamydia trachomatis sa mga nahawaang cells.

parasitolohiya

Sa larangan ng parasitolohiya, ang paglamlam ng Giemsa ay posible upang masuri ang mga sakit sa parasito tulad ng malaria, sakit na Chagas at leishmaniasis.

Sa unang dalawang mga parasito Plasmodium sp at Trypanosoma cruzi ayon sa pagkakabanggit ay makikita sa peripheral blood ng mga nahawaang pasyente, maaari silang matagpuan sa iba't ibang yugto depende sa phase kung saan ang sakit.

Upang mapabuti ang paghahanap para sa mga parasito sa dugo, inirerekomenda na gamitin ang mantsang Giemsa na halo-halong may mantsa ng May-Grünwald.

Gayundin, ang cutaneous leishmaniasis ay maaaring masuri sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga sample na biopsy ng balat ng balat na Giemsa na matatagpuan ang parasito.

Cytology

Ginagamit din ang paglamlam ng Giemsa para sa pag-aaral ng cytological ng mga sample ng endocervical, bagaman hindi ito ang madalas na ginagamit na pamamaraan para sa hangaring ito.

Ngunit sa mga kaso ng kakulangan ng mga mapagkukunan maaari itong magamit, pagkakaroon ng isang katulad na pag-andar sa na inaalok ng pamamaraan ng Papanicolaou at sa isang mas mababang gastos. Gayunpaman, nangangailangan ito ng kadalubhasaan sa bahagi ng tagasuri.

Cytogenetics

Ang isang nauugnay na tampok ng paglamlam ng Giemsa ay ang kakayahang magbigkis ng malakas sa adenine at thymine na mayaman na mga rehiyon ng DNA. Pinapayagan nitong makita ang DNA sa panahon ng cell mitosis, sa iba't ibang mga estado ng paghalay.

Ang mga pag-aaral na ito ay kinakailangan upang makita ang mga chromatic aberrations tulad ng mga duplication, pagtanggal o translocations ng iba't ibang mga rehiyon ng chromosome.

Ang pananaliksik na nagpapakita ng pagiging epektibo ng mantsang Giemsa

Ang Cannova et al (2016), inihambing sa 3 mga pamamaraan ng paglamlam para sa pagsusuri ng cutaneous leishmaniasis.

Para sa mga ito, ginamit nila ang mga sample na nakuha mula sa isang pang-eksperimentong hayop (Mesocrisetus auratus) na naka-eksperimentong inoculated kay Leishmanias.

Ipinakita ng mga may-akda na ang mantsang Giemsa ay mas mahusay kaysa sa mantsa ng Pap-mart® at Gaffney. Samakatuwid, isinasaalang-alang nila ang mantsang Giemsa na maging perpekto para sa pag-diagnose ng cutaneous leishmaniasis.

Ang mahusay na mga resulta na nakuha ng mga may-akda ay dahil sa ang katunayan na ang kumbinasyon ng mga tina na bumubuo sa halo ng Giemsa ay nagtatanghal ng mga kinakailangang kondisyon upang lumikha ng isang kanais-nais na kaibahan, na pinapayagan ang mga istruktura ng mga amastigotes na malinaw na makilala, kapwa intracellularly at extracellularly.

Ang iba pang mga pamamaraan (Pap-mart® at Gaffney) ay ginawa rin ito, ngunit sa isang mas mahina na paraan at sa gayon ay mas mahirap na mailarawan. Iyon ang dahilan kung bakit inirerekumenda ang mantsa ng Giemsa para sa diagnosis ng parasitological na leishmaniasis.

Gayundin, ang isang pag-aaral ni Ramírez et al (1994) ay sinuri ang pagiging epektibo ng mga stains ng Giemsa at Lendrum sa mga smunctival smears para sa pagkilala kay Chlamydia trachomatis.

Natukoy ng mga may-akda na ang mga mantsa ng Giemsa at Ledrum ay may pantay na pagtutukoy, ngunit natagpuan si Giemsa na mas sensitibo.

Ipinapaliwanag nito kung bakit ang mantsang Giemsa ay kasalukuyang madalas na ginagamit para sa pagsusuri ng mga impeksyong chlamydial, lalo na kung may kaunting mga mapagkukunan.

Pinagmulan: PanReac Applichem ITW Reagents. Mantok ng Giemsa. Bersyon 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spain.

Mga rekomendasyon para sa mahusay na paglamlam

Ang pagpapatayo ng mga sheet ay hindi dapat pinabilis. Ang isang makatwirang dami ng oras ay dapat asahan na matuyo ito sa bukas na hangin. Humigit-kumulang 2 oras.

Kulayan kaagad pagkatapos ng 2 oras para sa pinakamahusay na mga resulta.

Para sa mga smear upang maayos at mantsang mas mahusay, ang sample ay dapat ibinahagi sa slide sa isang paraan na ang isang manipis at unipormeng layer ay nananatiling.

Ang ginustong sample ng dugo ay maliliit na ugat, dahil ang smear ay ginawa nang direkta mula sa pagbagsak ng dugo at samakatuwid ang sample ay hindi naglalaman ng anumang mga additives, na pinapaboran ang pagpapanatili ng mga cellular na istruktura.

Gayunpaman, kung ang dugo ng venous ay ginagamit, ang EDTA ay dapat gamitin bilang isang anticoagulant at hindi heparin, dahil ang mga heparin ay karaniwang deforms cells.

Karaniwang mga pagkakamali sa paglamlam ng Giemsa

Sa pagsasagawa ng mga pagkakamali ng pangkulay na ito ay maaaring gawin. Pinatunayan ang mga ito ng biglaang mga pagbabago sa mga tonalities ng mga istruktura.

Lubhang asul na pangulay

Maaaring dahil ito sa:

• Napaka makapal na mga smear
• Nakakapangit na oras ng paglamlam
• Hugasan nang hindi sapat.
• Ang paggamit ng mga reagents na mas mataas sa neutral (alkalina) pH.

Sa ilalim ng mga kundisyong ito, ang mga kulay ng mga sumusunod na istraktura ay magulong, sa paraang ang mga erythrocytes sa halip na magpapanatili ng salmon-pink ay lilitaw na berde, ang mga butil ng mga eosinophil na dapat na stain brick red ay magiging bluish o grey at iba pa ay magkakaroon ng paglihis sa karaniwang tono.

Labis na kulay rosas na pangulay

Maaaring dahil ito sa:

• Hindi sapat na oras ng paglamlam.
• Mahaba o labis na paghuhugas.
• Masamang pagpapatayo.
• Paggamit ng mataas na acidic reagents.

Sa partikular na kaso na ito, ang mga istruktura na normal na mantsa ng asul ay hindi halos makikita, habang ang mga istruktura na may kulay rosas ay magkakaroon ng labis na pagpapakita.

Halimbawa: Ang mga pulang selula ng dugo ay magiging maliwanag na pula o maliwanag na orange, ang nuklear na chromatin ay lilitaw na maputla na kulay rosas, at ang mga eosinophil na butil ay mantsang malalim na maliwanag na pula.

Ang pagkakaroon ng mga precipitates sa smear

Ang mga sanhi ay maaaring:

• Gumamit ng marumi o hindi maayos na hugasan ng mga pelikula.
• Huwag hayaang matuyo nang maayos ang smear.
• Ang pag-iwan ng solusyon sa pag-aayos ng masyadong mahaba.
• Hindi sapat na paghuhugas sa pagtatapos ng paglamlam.
• Hindi sapat na pagsasala o walang pagsala ng kulay na ginagamit.

Ang pagkakaroon ng morphological artifact

Ang mga artifact ng Morpolohiya ay maaaring lumitaw sa mga smear, na ginagawang mahirap na mailarawan at bigyang kahulugan ang mga istruktura na naroroon. Ito ay dahil sa:

• Uri ng ginamit na anticoagulant, tulad ng heparin.
• Gumamit ng marumi, lumala o madulas na pelikula.

Mode ng imbakan

Matapos ang paghahanda, dapat na panatilihin ang pangulay sa temperatura ng silid (15 - 25 ° C), upang maiwasan ang paglamig. Dapat itong maiimbak sa isang mahigpit na saradong lalagyan ng amber.

Mga Sanggunian

1. Cannova D, Brito E at Simons M. Pagsusuri ng mga pamamaraan ng paglamlam para sa diagnosis ng cutaneous Leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW Reagents. Mantok ng Giemsa. Bersyon 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spain.
3. Clark G. Pagpapanatili ng mga pamamaraan (1981), 4thed. Williams at Willkins.
4. Inilapat na Klinikal na Chemical. Giemsa mantsa para sa mga diagnostic ng vitro. Distributor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F at Grazioso C. Katunayan ng mga mantsa ng Giemsa at Lendrum sa conjunctival smears para sa pagkilala kay Chlamydia trachomatis. Bol ng Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Pangkalahatang Mycology. 1994. 2nd Ed. Central University ng Venezuela, Mga Edisyon sa Library. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa mantsa." Wikipedia, Ang Malayang Encyclopedia. 1 Sep 2017, 01:02 UTC. Disyembre 6, 2018, es.wikipedia.org.