BACTERIAL SMEAR: MGA KATANGIAN AT PAGHAHANDA - BIOLOGY - 2024

Ang bacterial smear ay isang manipis na film smear ng isang suspensyon ng mga mikrobyo na bakterya na ginawa sa isang transparent na plate na salamin o slide, para sa pagmamasid sa ilalim ng isang light microscope.

Ang pagpapalawak sa anyo ng isang pelikula ay isinasagawa upang paghiwalayin ang mga microorganism hangga't maaari, dahil kung ang mga ito ay nakaayos na ang obserbasyon ay hindi malinaw.

Larawan 1. Ang bakterya na smear na nakikita sa ilalim ng isang pag-scan ng mikroskopyo. Pinagmulan: pixbay.com

Sa pag-aaral ng mga kultura ng bakterya, ang paghahanda ng smear, pag-aayos at pag-stain ay ginagamit upang mas mahusay na pag-aralan ang mga ito. Dahil sa maliit na sukat ng mga microorganism, ang paggamit ng isang optical mikroskopyo ay kinakailangan para sa kanilang pagmamasid.

Ang mga optical mikroskopyo ay mga mahahalagang instrumento para sa pagmamasid sa mga smear. Ginagamit ng mga ito ang mga optical lens at ilaw na nagpapahintulot sa pagtingin ng mga sample na may mataas na kadahilanan.

Sa pangkalahatan, ang mga nabubuhay na cell ay walang karamihan na may kulay na mga istraktura, na nakikita gamit ang light mikroskopyo ang mga ito ay walang kulay, transparent na mga sample, at ipinakita nila ang napakakaunting panloob na kaibahan at sa kanilang kapaligiran.

Ang pagmamasid gamit ang simpleng mikroskopyo na light-field light, nang walang paggamit ng mga diskarte sa paglamlam ng pantulong, ay limitado at ginagamit lamang sa ilang mga kaso, tulad ng sa pag-obserba ng paggalaw ng mga microorganism.

Para sa pinakamainam na pag-obserba ng mga microorganism, dapat magkaroon ng isang balanse sa pagitan ng kaibahan at paglutas. Ang mga detalye ng cell ay hindi makikita sa ilalim ng isang mikroskopyo, kahit na may mataas na resolusyon; Kinakailangan ang paggamit ng mga tina sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng paglamlam, na nagbibigay ng kaibahan para sa pagmamasid.

Mga katangian ng isang mahusay na kalidad ng bakterya smear

Napakahusay na kaibahan

Upang makamit ang mahusay na kaibahan mayroong mga sopistikadong mikroskopyo na tinatawag na phase contrast microscope, pagkakaiba sa pagkagambala mikroskopyo, at madilim na microscope. Ang ganitong uri ng mikroskopyo ay ginagamit upang obserbahan ang mga istruktura ng bakterya tulad ng mga kaluban at filament, bukod sa iba pa.

Ang paglamlam ay isang simpleng pamamaraan upang madagdagan ang kaibahan na nakamit na may isang mikroskopyo ng brightfield. Sa pamamaraang ito, maaaring magamit ang iba't ibang mga mantsa, na makabuluhang mapabuti ang obserbasyon ng mikroskopiko.

Ang mga mantsa ay isinasagawa nang direkta sa mga smear o extension ng mga suspensyon ng microorganism sa mga slide, na dati nang tuyo at maayos.

Magandang pag-ayos

Ang pag-aayos ay isang pamamaraan na ginagamit upang mapanatili ang mga istruktura ng cell; nagiging sanhi ng hindi aktibo ng mga microorganism at pagdirikit sa baso ng slide. Mayroong iba't ibang mga pag-aayos ng paggamot: pag-aayos ng init at pag-aayos ng kemikal.

Pag-aayos ng init

Ito ang pinaka-malawak na ginagamit na pamamaraan para sa pagmamasid sa mga smear ng bakterya. Ang pamamaraan ay binubuo ng pagpasa ng bacterial suspension ng smear sa pamamagitan ng siga ng isang magaan. Ang pamamaraan na ito ay nakapagtatago ng panlabas na morpolohiya ng bakterya, ngunit sinisira ang kanilang mga panloob na istraktura.

Pag-aayos ng kemikal

Ang pag-aayos ng kemikal ay gumagamit ng pangangalaga ng mga kemikal, tulad ng formaldehyde o formalin, ethanol at acetic acid, bukod sa iba pa. Ang bentahe ng paggamit ng mga ahente ng pag-aayos ng kemikal ay ang pag-iingat ng panloob na mga cellular na istruktura ng mga microorganism ay nakamit.

Larawan 2. smear ng dugo. Pinagmulan: Bobjgalindo, mula sa Wikimedia Commons

Magandang paglamlam

Ang pinakakaraniwang pamamaraan para sa paglamlam ng dati nang tuyo at naayos na pahid ay positibo o simpleng paglamlam, paglamlam ng kaugalian, at negatibong paglamlam. Mayroon ding mga espesyal na pamamaraan para sa paglamlam ng mga partikular na istruktura ng cell (kapsula, spore, flagella).

Positibong paglamlam o simpleng paglamlam

Ang positibo o simpleng paglamlam ay ang pinaka-malawak na ginagamit na diskarte sa paglamlam ng smear. Gumagamit ito ng mga tina na may kakayahang magbigkis sa ilang mga istraktura ng microbial, na pinapayagan silang sundin sa ilalim ng isang mikroskopyo.

Ang mga tina na ito ay may mga pangkat ng chromophore (kulay na bahagi) sa kanilang kemikal na istraktura, na may alternating dobleng mga bono at solong mga bono (conjugation). Ang mga bono na ito ay maaaring magtatag ng ionic o covalent bond na may ilang mga cellular na istraktura.

Ang mga tina na ginamit sa positibo o simpleng paglamlam ay karamihan sa mga kemikal na derivatives ng aniline (kulay na mga organikong asing-gamot).

Sa kabilang banda, kabilang sa mga tina maaari naming mahanap ang ilan na may isang pangunahing pH at ang iba na may acidic pH.

Mga pangunahing kulay

Sa pangunahing mga tina, ang pangkat ng chromophore ay may positibong singil sa kuryente. Ang karamihan sa mga prokaryotic microorganism ay may isang neutral na internal na pH, at ang kanilang cell ibabaw ay negatibong sisingilin. Sa pamamagitan ng pakikipag-ugnay sa electrostatic na ito, ang chromophore ay nagbubuklod sa cell at tinutuyo ito.

Ang mga halimbawa ng pangunahing mga tina ay asul na methylene, crystal violet, malachite green, basic fuscin, safranin, at iba pa.

Mga tina sa asido

Sa mga acid dyes, ang pangkat ng chromophore ay may negatibong singil sa kuryente. Ginagamit ang mga ito upang mantsang mga protina na may positibong sisingilin ng mga grupo ng amino. Ang mga halimbawa ng acid dyes ay acid fuscin, rosas na Bengal, Congo pula, at eosin.

Pagkakaiba sa paglamlam

Ang diskarteng paglamlam ng kaugalian ay binubuo ng paglalapat ng dalawang tina ng iba't ibang kulay o intensity, upang makilala ang iba't ibang mga microorganism sa ilalim ng mikroskopyo. Ang mantsa ng Gram at ang mantsa ng paglaban sa acid-alkohol ay ang pinaka-karaniwang ginagamit na mga stain ng kaugalian sa bacteriology.

Ang mantika ng Gram ay ginagamit bilang isang paunang pagsubok upang malaman ang hugis, sukat, pag-aayos ng cell, pati na rin ang uri ng cell wall. Gamit ang pagsubok na mantsa ng Gram, ang bakterya ng cell wall ay inuri sa mga positibong bakterya ng Gram at negatibong bakterya ng Gram.

Negatibong paglamlam

Sa pamamaraang ito, ang mga colorant ng kemikal ay ginagamit na hindi tumagos sa interior ng cell, ngunit gumawa ng daluyan kung saan lumilitaw ang mga microorganism bilang isang itim na background.

Sa negatibong diskarte sa paglamlam, ang smear ay ginawa mula sa isang pagbagsak ng tinta ng India o suspensyon ng nigrosin, na pagkatapos na payagan ang pagpapatayo sa temperatura ng silid ay bumubuo ng isang maselan na pelikula sa daanan ng ilaw. Sa ganitong paraan, ang mga microorganism ay lumilitaw bilang maliwanag na mga hugis sa isang madilim na background.

Paghahanda

A. pahid

1.- Hugasan nang mabuti ang mga slide, tuyo na may sumisipsip na papel at lagyan ng label ang mga ito. Dapat ipahiwatig ng label ang nilalaman ng paghahanda, petsa at ang pangalan ng taong nagpoproseso nito.

2.- Banayad ang magaan at isterilisado ang inoculation loop sa apoy hanggang sa maliwanag na pula.

3.- Hayaan ang hawakan cool.

4.- Kunin ang tubo ng kultura ng bakterya, alisin ang takip at mabilis na ipasa ang bibig ng tubo malapit sa apoy ng burner (siga.

5.- Ipasok ang inoculation loop sa tubo na naglalaman ng kultura ng bakterya at kunin ang halimbawang.

6.- Kung ang kultura ay nasa likidong daluyan, ilagay ang halimbawang kinuha gamit ang hawakan sa gitna ng slide at maingat na maikalat ito sa isang bilog na humigit-kumulang na 2 cm ang lapad.

7.- Sterilize muli ang inoculation loop.

8.- Payagan ang smear na matuyo sa hangin.

9.- Ulitin ang mga hakbang 3 hanggang 8 tatlong beses.

10.- Kung ang kultura ay nasa solidong daluyan, ang isang patak ng distilled water ay dapat na ilagay sa slide. Ginagawa ito upang paghaluin ang isang maliit na sample ng kultura na kinunan gamit ang inoculation loop, tulad ng nakadirekta sa mga hakbang 2 hanggang 5 (mga kondisyon ng aseptiko).

11.- Ikalat ang tinunaw na sample na may pagbagsak ng tubig sa slide at ulitin nang tatlong beses.

B. Pag-aayos

1.- Magdagdag ng dalawang patak ng methanol o ganap na ethanol sa tuyong mga smear - mula sa mga kultura sa medium medium -.

2.- Payagan ang pagpapatuyo ng hangin palayo sa magaan.

3.- Kung ang pahid ay nagmula sa isang kultura sa solidong daluyan, ang tuyong pahid ay naayos na may init, na ipinapasa ito ng 2 hanggang 3 beses nang mabilis sa pamamagitan ng pinakamainit na bahagi ng mas magaan na apoy.

4.- Pindutin ang ibabang bahagi ng pahid gamit ang dorsal na bahagi ng kaliwang kamay (para sa mga kanang kamay; kung hindi man, gamitin ang kanang kamay) at patunayan na ito ay malamig.

C. Simpleng paglamlam

1.- Magdagdag ng 2 patak ng napiling mantsa sa pahid at iwanan upang kumilos para sa oras na kinakailangan sa mga tiyak na protocol para sa bawat mantsa (sa pangkalahatan sa pagitan ng 1 at 5 minuto).

2.- Ang ilang mga mantsa ay nangangailangan ng paggamit ng init para sa kanilang pag-activate, kung saan kinakailangan na maging maingat kapag nagpainit ng slide sa mas magaan na apoy (manipulahin ito sa mga sipit at maiwasan ang kumukulo). Ang sobrang pag-init ng smear ay maaaring sirain ang mga cell na dapat sundin.

3.- Alisin ang labis na kulay sa pamamagitan ng paghuhugas ng distilled water mula sa isang picette. Alisin ang hugasan ng tubig sa pamamagitan ng malumanay na pag-tap sa slide sa gilid nito, tumagilid sa talahanayan ng trabaho.

4.- Payagan ang pagpapatayo ng hangin.

5.- Depende sa uri ng pagmamasid, ang isang takip ay ginagamit o hindi sa yugtong ito. Ang mga coverlip ay pinoprotektahan at pinapanatili ang pahid. Kung ang pagmamasid sa langis sa pagsasawsaw ay ginawa sa yugtong ito, walang mga takip na ginagamit ngunit ang smear ay hindi mapangalagaan.

D. Natutukoy na pangangalaga ng smear

1.- Isawsaw ang matagumpay na pahid sa bawat isa sa mga solusyon na ipinahiwatig sa ibaba, para sa isang minimum na 5 minuto. Ang layunin ng mga "paliguan" na ito ay upang ganap na maligo ang pahid. Ang bawat reagent ay dapat na lubusan na malinis bago ipakilala ang pahid sa susunod na paliguan.

Ang pagkakasunud-sunod ng mga naligo na paliguan ay ang mga sumusunod:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Puro acetone
4. Acetone -xylol 1: 1 pinaghalong
5. Xylol

Pagkatapos ay payagan upang matuyo ang hangin.

2.- I-mount ang mga takip, mas mabuti 22 × 22 mm, gamit ang Canada balsam o iba pang mounting medium.

Mga Sanggunian

1. Briggs, G. (1965). Mga Sanhi ng Mga Sanhi sa Mga Aksidente at Impeksyon sa Microbiological Laboratory. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG at Welch, CT (2017). Mikrobiology: Isang Manwal ng Laboratory. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). Ang mas maiikling Manwal ni Bergey ng Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: Ang Williams at Wilkins Co.
4. Johnson, TR at Kaso; CL (2018). Mga Eksperimento sa Laboratory sa Microbiology. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostic Microbiology. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.