IMMUNOFLUORESCENCE: MAKATUWIRAN, PROTOCOL, AT APLIKASYON - BIOLOGY - 2025

Ang immunofluorescence ay isang malakas na pamamaraan na immunostaining gamit ang mga antibodies covalently bonded na nakatali sa mga fluorescent molekula upang makilala ang mga tukoy na target sa mga sample ng cell na naayos sa isang solidong suporta.

Ang pamamaraan na ito ay nagsasangkot ng obserbasyon ng mikroskopiko na may tiyak na immunological, na ginagawang posible upang obserbahan ang mga live o patay na mga selula na maaaring magpakita ng mga minuscule na halaga ng antigens. Malawakang ginagamit ito kapwa sa larangan ng pananaliksik at sa klinikal na diagnosis ng iba't ibang mga pathologies.

Immunolabeling ng mga filamentong actin sa mga selula ng cardiomyocyte (Pinagmulan: Ps1415 sa pamamagitan ng Wikimedia Commons)

Ang diskarteng ito, pangunahin sa husay (na may ilang mga variant ng dami), ay kailangang gawin partikular sa paggunita ng isang sample ng signal ng produkto ng isang fluorophore, na isang molekong fluorescent na nakatali sa isang antibody at kung saan ay may kakayahang maging nasasabik sa isang tiyak na haba ng haba .

Sa kontekstong cellular ay napaka-kapaki-pakinabang upang pag-aralan ang pagkakaroon / kawalan at subcellular lokasyon ng mga protina. Ang pamamaraan ay una na ginamit sa klinikal na setting para sa pagsusuri ng mga virus tulad ng trangkaso at kasunod para sa maraming iba pang mga nakakahawang sakit.

Ito ay isang napaka-sensitibong pamamaraan, at sa naaangkop na kagamitan sa mikroskopya, maaari itong magkaroon ng napakahusay na paglutas. Kinakailangan, para sa pagmamasid nito, ang paggamit ng mga confros o epifluorescence microscope.

Gayunpaman, sa kabila ng pagiging napakapopular, maaari itong ipakita ang ilang mahahalagang problema na may paggalang sa pagkuha ng nonspecific fluorescence na bumubuo ng ilang "ingay", na madalas na nililimitahan ang sapat na pagbasa ng mga resulta.

Batayan

Ang immunofluorescence ay batay sa pagsasamantala ng biological na kababalaghan ng reaksyon ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng isang antibody at isang antigen. Kailangan itong gawin partikular sa paggunita o pagtuklas ng reaksyong ito sa pamamagitan ng kapana-panabik na mga molekulang fluorescent sa isang tiyak na haba ng haba.

Ang isang antibody ay isang protina na immunoglobulin na tinago mula sa mga aktibong selula ng B, na partikular na nabuo laban sa isang antigen, kung saan maaari itong magbigkis ng may mataas na pagkakaugnay at pagtitiyak. Ang immunofluorescence ay gumagamit ng IgG immunoglobulins, na natagpuan natutunaw sa suwero ng dugo.

Ang mga antibiotics ay mga molekula ng hanggang sa 950 kDa na binubuo ng dalawang maiikling (ilaw) at dalawang mahaba "Y" -shaped (mabigat) peptide chain. Parehong ang ilaw at mabibigat na kadena ay nahahati sa dalawang mga domain: isang variable, may kakayahang kilalanin ang antigen, at ang iba pang pare-pareho o natipid, katangian ng bawat species.

Ang mga antigen ay functionally na tinukoy bilang mga molekula na maaaring kilalanin ng isang antibody at, para sa karamihan, mga protina. Kapag ang isang hayop ay nakalantad sa isang antigen, ang mga lymphocytes ng immune system ay isinaaktibo, na gumagawa ng mga tukoy na antibodies laban dito at gumana bilang isang sistema ng pagtatanggol.

Ang isang antigen, tulad ng isang protina, halimbawa, ay maaaring magkaroon ng higit sa isang epitope o site ng pagkilala ng isang antibody, sa gayon ang suwero ng hayop na nakalantad sa isang antigen ay maaaring magkaroon ng mga polyclonal antibodies laban sa iba't ibang mga rehiyon ng parehong protina.

Kung gayon, sinasamantala ng Immunofluorescence ang kakayahan ng isang hayop na gumawa ng polyclonal antibodies laban sa isang tiyak na antigen upang linisin ito at pagkatapos ay gamitin ito para sa pagtuklas ng parehong antigen sa iba pang mga konteksto.

Kabilang sa mga fluorescent dyes o molekula na kadalasang ginagamit para sa ilang mga immunofluorescence technique ay ang fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 at 6 (TRITC), maraming mga cyanines tulad ng Cy2, Cy3, Cy5 at Cy7 at dyes na tinatawag na Alexa Fluor® , tulad ng Alexa Fluor®448.

Protocol

Ang protocol ng immunofluorescence ay nag-iiba depende sa maraming mga kadahilanan, gayunpaman, sa mga pangkalahatang termino, sumasaklaw ito sa isang guhit na pagkakasunod-sunod ng mga hakbang na binubuo ng:

• Paghahanda ng mga plate at cell
• Pag-aayos ng mga sample
• Pagiging perpekto
• Paghaharang
• Pagbabakuna o pagbabakuna
• Assembly at obserbasyon

-Preparasyon

Sa mga sample

Ang paghahanda ng mga sample ay depende sa kanilang likas at ang uri ng karanasan na isinasagawa. Ang pinakasimpleng kaso, na nagsasangkot sa paggamit ng mga cell sa pagsuspinde, ay ipapaliwanag sa ibaba.

Ang mga cell sa pagsuspinde, iyon ay, sa isang medium medium na kultura, dapat munang ihiwalay mula dito sa pamamagitan ng pagsasakripisyo at pagkatapos ay dapat hugasan ng isang buffer solution o isosmotic "buffer", na pinapanatili ang kanilang integridad.

Karaniwan, ang isang pospeyt-saline buffer na kilala bilang PBS ay ginagamit, kung saan ang mga cell ay resuspended at ang halo na ito ay sentripuged muli upang makuha ang mga cell na wala sa medium medium, na maaaring maglaman ng mga nakakasagabal na sangkap.

Ng mga blades

Ang mga slide na ginamit para sa mikroskopikong pagmamasid, kung saan ang mga cell ay kalaunan ay maaayos para sa kaukulang mga paggamot sa agos ng agos, dapat ding maingat na ihanda.

Ang mga ito ay sakop o "sensitized" sa isang solusyon ng poly-lysine, isang synthetic polymer na kikilos bilang isang "molekular na pandikit" sa pagitan ng mga cell at ng solidong suporta, salamat sa pakikipag-ugnayan ng electrostatic sa pagitan ng mga positibong singil ng kanilang mga grupo ng amino at ang negatibong singil sa mga protina na nagsusuot ng mga selula.

Pag-aayos ng mga sample

Ang prosesong ito ay binubuo ng immobilizing na mga protina na matatagpuan sa loob ng cell upang mapanatili ang buo nilang lokasyon. Ang mga molekula na ginamit ay dapat may kakayahang tumawid sa lahat ng mga uri ng mga lamad ng cell at bumubuo ng mga lattice na may mga protina ng covalent.

Ang Formaldehyde at paraformaldehyde, glutaraldehyde at maging ang methanol ay malawakang ginagamit, na kung saan ang mga sample ng cell ay natupok para sa isang tiyak na oras at pagkatapos ay hugasan ng isang isosmotic buffer solution.

Matapos ayusin ang mga cell, patuloy silang nakadikit sa mga sheet na dati nang na-sensitibo sa poly-lysine.

Pagiging perpekto

Depende sa uri ng pagsubok na isinasagawa, kakailanganin upang mapangasiwaan ang mga selula sa ilalim ng pag-aaral o hindi. Kung ang hinahangad ay malaman ang lokasyon, pagkakaroon o kawalan ng isang tiyak na protina sa ibabaw ng cell, hindi kinakailangan ang permeabilization.

Sa kabilang banda, kung nais mong malaman ang lokasyon ng isang protina sa loob ng cell, ang permeabilization ay mahalaga at binubuo ng incubating ang mga sample na may Triton X-100, isang naglilinis na may kakayahang permeabilizing cell lamad.

Paghaharang

Ang isang pangunahing hakbang sa lahat ng mga diskarte sa immunological ay ang pagharang. Sa yugtong ito ng pamamaraan, ang pagharang ay binubuo ng takip, sa mga sensitibong sheet, ang lahat ng mga site na may mga poly-lysine molekula na kung saan ang mga cell ay hindi sumunod. Iyon ay, pinipigilan ang anumang walang kapararasang unyon.

Karaniwan ang mga solusyon na may bovine serum albumin (BSA) sa PBS buffer ay ginagamit para sa pagharang at ang pinakamahusay na mga resulta ay nakuha mas matagal ang oras ng pagpapapisa ng itlog sa solusyon na ito. Matapos ang bawat hakbang, kabilang ang pag-block, kinakailangan na hugasan ang natitirang solusyon.

Pagbabakuna o pagbabakuna

Ang pamamaraan ng immunostaining o immunostaining ay depende sa pangunahin sa kung ito ay isang direkta o hindi direktang immunofluorescence (tingnan sa ibaba).

Kung ito ay isang pangunahin o direktang immunofluorescence, ang mga sample ay mapapawi sa nais na mga antibodies, na dapat na isama sa mga fluorescent dyes. Ang pamamaraan ng pagpapapisa ng itlog ay binubuo ng paggawa ng isang pagbabanto ng antibody sa isang solusyon na maglalagay din ng BSA ngunit sa isang mas mababang proporsyon.

Kung ang kaso ay nasa pangalawang o hindi direktang immunofluorescence, dapat na isagawa ang dalawang magkakasunod na pagpapapisa. Una sa ninanais na mga antibodies at pagkatapos ay sa mga antibodies na may kakayahang tuklasin ang palagiang mga rehiyon ng pangunahing immunoglobulins. Ito ang mga pangalawang antibodies na covalently ay nakatali sa mga fluorophores.

Ang pamamaraan ay napaka-maraming nalalaman, na nagpapahintulot sa sabay-sabay na pag-label ng higit sa isang antigen bawat sample, hangga't mayroong pangunahing mga antibodies na isinama sa iba't ibang mga fluorophores, sa kaso ng direktang immunofluorescence.

Para sa sabay-sabay na pag-label sa hindi direktang immunofluorescence, kinakailangan upang matiyak na ang bawat pangunahing antibody ay ginawa sa ibang hayop, pati na rin ang bawat pangalawang antibody ay isinama sa ibang fluorophore.

Tulad ng pagharang, ang pagpapapisa ng itlog na may mga antibodies ay nagbibigay ng mas mahusay na mga resulta mas mahaba ang oras nito. Matapos ang bawat hakbang ay kinakailangan na hugasan ang labis na mga antibodies na hindi nagbubuklod sa mga sample at sa pangalawang immunofluorescence kinakailangan na i-block bago idagdag ang pangalawang antibody.

Ang ilang mga diskarte ay gumagamit ng iba pang mga mantsa na hindi nauugnay sa immunostaining, tulad ng paglamlam ng nuklear na DNA kasama ang DAPI fluorophore.

Assembly at obserbasyon

Sa panghuling oras ng pagpapapisa ng itlog kasama ang mga fluorophores kinakailangan na manatiling madilim ang mga sample. Para sa pagmamasid sa ilalim ng mikroskopyo, karaniwan na gumamit ng ilang mga sangkap upang mapanatili ang fluorescence ng fluorophores na isinama sa mga antibodies.

Mga Uri

Ang buod ng graphic ng direkta at hindi direktang immunofluorescence (Pinagmulan: Westhayl618 sa pamamagitan ng Wikimedia Commons)

Direkta o pangunahing immunofluorescence

May kinalaman ito sa pagtuklas ng mga antigen sa pamamagitan ng paggamit ng mga fluorescent antibodies. Ang pangunahing bentahe ng paggamit ng diskarteng ito ay ang bilis nito, gayunpaman, maraming mga kaso ng walang kapararakan na pagbubuklod ang maaaring mangyari sa proseso, lalo na kapag pinag-aaralan ang sera ng tao, dahil mayaman sila sa mataas na mga heterogenous na mga antibodies.

Hindi direkta o pangalawang immunofluorescence

Kilala rin ito bilang "sandwich" na pamamaraan at kabilang dito ang pag-unlad ng pamamaraan sa dalawang hakbang. Ang una ay may kinalaman sa paggamit ng isang non-fluorescent antibody at ang pagkakagapos nito sa antigen ng interes.

Laban sa patuloy na rehiyon ng unang antibody na ito (na ngayon ay magsisilbing antigen) isang pangalawang antibody na may kakayahang makilala ito ay ginagamit, na nauugnay sa isang fluorescent molekula.

Ang hitsura ng isang fluorescent signal ay magiging resulta ng tukoy na pagkilala sa pagitan ng unang non-fluorescent antibody at ang antigen ng interes; ang pagkakaroon ng mga unang kondisyon ng antibody na ng pangalawa, na kung saan ay may label at salamat sa kung saan ang pagkakaroon o kawalan ng antigen ay maaaring matukoy.

Sa kabila ng pagiging isang mas maraming oras na pamamaraan kaysa sa direktang immunofluorescence (dahil kasama nito ang isa pang hakbang sa pagpapapisa ng itlog), ang pamamaraan na ito ay hindi kasangkot sa disenyo ng isang fluorescent antibody para sa bawat antigen na pinag-aralan, na nagreresulta, sa mga pang-ekonomiyang termino, mas mabubuhay.

Bukod dito, ito ay isang mas sensitibong pamamaraan sa mga tuntunin ng pagpapalakas ng signal, dahil higit sa isang pangalawang antibody ay maaaring magbigkis sa pare-pareho na rehiyon ng pangunahing antibody, kaya pinalakas ang intensity ng signal ng fluorescent.

Aplikasyon

Tulad ng maaaring napansin sa nakaraan, ang immunofluorescence ay isang napaka-maraming nalalaman pamamaraan, na ginamit sa maraming mga paraan sa mga pang-agham at klinikal na larangan. Maaari itong magamit upang sagutin ang mga katanungan sa ekolohiya, genetic, at physiological tungkol sa maraming mga organismo.

Kabilang sa mga klinikal na aplikasyon, ginagamit ito para sa direktang pagsusuri ng ilang mga sakit sa dermatological, alinman sa paggamit ng direkta o hindi direktang immunofluorescence sa epithelial tissue ng mga pasyente na pinag-aralan.

Ang mga diskarte sa immunofluorescence ay magagamit sa mga unicellular organismo tulad ng lebadura upang mailarawan ang intranuclear at cytoplasmic microtubule, actin at mga nauugnay na protina, 10nm filament, at iba pang mga nasasakupan ng cytoplasm, lamad, at mga cell pader.

Mga Sanggunian

1. Abcam, Immunocytochemistry at immunofluorescence protocol. Nakuha mula sa abcam.com
2. Greph, C. (2012). Mga Pinta ng Fluorescent. Nakuha mula sa leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluorescence Microscopy. Sa Mga Paraan sa Cell Biology (Tomo 48, pp. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Mga Teknong Immunofluorescence. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Mga pamamaraan ng immunofluorescence para sa lebadura. Sa Mga Paraan ng Enzymology (Tomo 194, pp. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Mga aplikasyon ng immunofluorescence sa Public Health Virology. Mga Review sa Bacteriological, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996) Immunofluorescence sa pananaliksik ng phytoplankton: mga aplikasyon at potensyal. J: Phycol. , 32, 1–16.