LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: PUNDASYON, PAGHAHANDA AT PAGGAMIT - BIOLOGY - 2024

Ang Löwenstein-Jensen medium ay isang selective solid medium para sa paghihiwalay at pag-unlad ng mga bakterya ng genus Mycobacterium, tulad ng Mycobacterium tuberculosis, M. avium, bukod sa iba pa, na may pagbubukod sa mga species ng leprae, na hindi masuri.

Ang bakterya ng genus Mycobacterium ay hindi lumalaki sa maginoo na media media, samakatuwid kinakailangan na magdisenyo ng isang espesyal na daluyan para sa kanilang paghihiwalay. Ang orihinal na daluyan ay nilikha ng Löwenstein at kalaunan ay binago ni Jensen.

Löwenstein-Jensen medium na may mga kolonya ng Mycobacterium tuberculosis. Pinagmulan: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., kagandahang-loob ng Library Library ng Biology

Ang pagbabago ay binubuo sa pag-aalis ng pulang dye ng Congo, pinalitan ito ng isang mas mataas na konsentrasyon ng berachite green. Binago din nito ang mga konsentrasyon ng magnesium citrate at monopot potassium phosphate.

Ang Löwenstein-Jensen medium ay kasalukuyang naglalaman ng patatas na patatas, asparagine, magnesium citrate, monopot potassium phosphate, magnesium sulfate, malachite green, nalidixic acid, cycloheximide, lincomycin, pinalo ng itlog, gliserin, at tubig.

Ang Mycobacteria ay normal na nakahiwalay sa mga site na hindi makinis, tulad ng plema, ihi, abscesses, bukod sa iba pa. Nangangahulugan ito na ang karamihan sa mga sample ay naglalaman ng karaniwang microbiota ng lugar, kasama ang pathogen.

Iyon ang dahilan kung bakit ang medium ng Löwenstein-Jensen ay naglalaman ng isang serye ng mga inhibitor sa komposisyon nito na kinakatawan ng malachite green, antibiotics at antifungals.

Bilang karagdagan, ang mga halimbawang nagmula sa mga site na hindi matuyo ay dapat na decontaminated at ma-neutralize bago ma-seeded sa medium ng Löwenstein-Jensen.

Batayan

Ang pagkakaroon ng itlog at gliserin sa medium ng Löwenstein-Jensen ay pinasisigla ang paglaki ng mycobacteria dahil nagbibigay sila ng mga fatty acid at protina na kinakailangan para sa pagpapaunlad ng mga microorganism na ito.

Ang Löwenstein-Jensen medium ay naglalaman ng malachite green, na kung saan ay isang inhibitor ng kasamang microbiota. Ngunit naglalaman din ito ng nalidixic acid (35 µg / mL), na pumipigil sa Gram negatibong microbiota, cycloheximide (400 µg / mL), na pumipigil sa saprophytic fungi at yeast, at lincomycin (2 µ / mL), na pumipigil sa Gram na positibong microbiota.

Mas gusto ng ilang mga komersyal na bahay na idagdag ang sumusunod na kumbinasyon ng mga antibiotics: polymyxin B 200,000 mga yunit / L, amphotericin B 10 mg / L, carbenicillin 50 mg / L at trimethoprim 10 mg / L.

Ang daluyan na ito ay hindi naglalaman ng agar, samakatuwid ang solidification ng daluyan ay nangyayari dahil sa coagulation ng albumin na naroroon sa itlog sa panahon ng isterilisasyon.

Paghahanda

Timbang 37.3 g ng dehydrated medium sa 600 ml ng distilled water na kung saan ang 12 ML ng gliserol ay naidagdag na dati. Ang halo ay pinainit, pagpapakilos nang madalas hanggang sa ganap na matunaw. Autoclave ang daluyan sa 121 ° C sa loob ng 15 minuto.

Sa kabilang banda, ang isang homogenous suspension ng 1000 ML ng mga sariwang itlog ay dapat ihanda sa ilalim ng mga kondisyon ng aseptiko. Idagdag ang suspensyon ng itlog sa 600 ML ng daluyan na inihanda sa temperatura na 50 - 60 ° C, pag-iwas sa mga bula ng hangin.

Ang mga solusyon sa antibiotics ay idinagdag pagkatapos ng isterilisasyon sa autoclave.

Ibuhos ang daluyan sa mga sterile na mga tubo ng pagsubok na naka-takip. Init ang mga tubo sa 85 ° C sa loob ng 45 minuto sa isang nakakiling posisyon.

Ang kulay ng handa na daluyan ay ang aquamarine berde at maaaring magpakita ng mga maputi na lugar dahil sa pagkakaroon ng mga itlog ng lipid.

Ang pH ng daluyan ay dapat na 7.2 ± 0.2

Pagtabi ng mga tubo sa isang ref at protektado mula sa direktang ilaw hanggang sa paggamit. Ang temperatura bago ang paghahasik.

Mayroong isang pagbabago ng daluyan na tinatawag na "Gruft modification ng Löwenstein Jensen". Naglalaman ito ng parehong mga compound tulad ng klasikong daluyan ngunit ang RNA-5mg / 100 mL ay idinagdag, at bilang mga inhibitor ito ay naglalaman ng malachite green na 0.025 g / 100 mL, penicillin 50 U / mL at nalidixic acid 35 ug / mL.

Aplikasyon

Ang Löwenstein-Jensen medium ay ginagamit para sa paghihiwalay ng mycobacteria mula sa iba't ibang uri ng mga sample. Ang isang Ziehl-Neelsen stain ay inirerekomenda para sa anumang ispesimen kung saan ang pagkakaroon ng mycobacteria ay pinaghihinalaan.

Ang ilang mga halimbawa ay nagmula sa mga sterile site ngunit ang iba ay hindi. Ang mga di-sterile na mga sample ay dapat na ma-decontaminated na naaangkop:

Sputum

Ang mga sample ng plema ay dapat na decontaminated tulad ng sumusunod: matukoy ang halaga ng sample ng plema sa ml at idagdag ang parehong halaga ng 4% NaOH sa sample at incubate sa 37 ° C.

Iling ang madalas na pinaghalong sa loob ng 30 minuto. Kasunod na sentripuge sa 3000 RPM sa loob ng 30 minuto.

Itapon ang supernatant sa isang hindi pangkaraniwang solusyon ng disimpektante. Gumamit ng sediment para sa paghahasik, ngunit una ang pH ay dapat neutralisado.

Upang neutralisahin ang sediment, 5% H ₂ KAYA ₄ ang ginagamit sa pagkakaroon ng tagapagpahiwatig ng phenol red hanggang sa maabot nito ang isang neutral na ph na nagdudulot ng kulay ng salmon.

Gastric lavage, bronchial lavage, at bronchial aspirate

Sa kasong ito, ang sample ay dapat na nakasentro sa 3000 RPM sa loob ng 30 minuto. Ang supernatant ay itinapon at ang pellet ay ginagamit. Upang masuri ang sediment, magdagdag ng 3 ml ng 4% NaOH at madalas na pukawin sa 37 ° C para sa isang panahon ng kalahating oras.

Centrifuge muli, ang supernatant ay itinapon at ginagamit ang pellet. Ang huli ay dapat na neutralisahin tulad ng ipinaliwanag sa sample ng plema.

Ihi

Payagan ang sample upang manirahan sa ref sa loob ng 24 na oras. Paghiwalayin ang supernatant. Ang natitirang pellet ay dapat na sentripuged para sa 30 minuto sa 3000 RMP. Itapon muli ang supernatant at muling pagbigyan ang pellet na may 3 ml na sterile physiological solution.

Magdagdag ng 3 ml ng 4% NaOH at magpatuloy sa decontamination at neutralization tulad ng inilarawan sa nakaraan.

Ang mga ascite fluid, pleural fluid, cerebrospinal fluid

Sa ganitong uri ng sample na ito ay naka-centrifuged at ang supernatant ay itinapon. Magsagawa ng Gram sa sediment o obserbahan nang direkta sa ilalim ng mikroskopyo; Kung ang mga bakterya ay hindi sinusunod, ang hakbang sa decontamination ay hindi kinakailangan, o ang hakbang sa pag-neutralisasyon.

Sa kasong ito ang sample ay maaaring maihasik nang direkta gamit ang sediment. Kung mayroong bakterya, magpatuloy sa pag-decontaminate at neutralisahin tulad ng inilarawan sa itaas.

Mga Biopsies

Sa ganitong uri ng sample, ang 5 ml ng distilled water ay dapat idagdag sa kalaunan na centrifuge sa 1500 RPM sa loob ng 10 minuto. Itapon ang supernatant at muling isentro ang pellet sa 3500 RPM sa loob ng 30 minuto. Gumamit ng sediment upang maghasik ng medium medium.

Laryngeal swab

Ang pamunas ay dapat na mailagay sa isang sterile tube na naglalaman ng pantay na mga bahagi ng distilled water at 4% NaOH. Ang pamamaluktot ay dapat pindutin laban sa mga dingding ng tubo upang ang sample ay lasaw sa likido. Centrifuge at gamitin ang sediment. I-neutralize ang sediment tulad ng inilarawan na.

Sown

Ang medium ng Löwenstein-Jensen ay inoculated sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 0.5 ml ng sample sa ibabaw ng medium. Paikutin ang tubo upang ipamahagi ang sample sa buong daluyan. Huwag gumamit ng panghawak ng platinum.

Ang isang pangalawang tubo na naglalaman ng Stonebrink medium ay maaaring ma-seeded upang maihiwalay ang Mycobacterium bovis at iba pang mga species na hindi lumalaki sa medium ng Löwenstein-Jensen.

Pagkaputok

Ang mga inoculated tubes ay incubated aerobically sa 37 ° C, na may takip na bahagyang maluwag at nakakiling sa tinatayang 5 ° at protektado mula sa ilaw. Ang kapaligiran ay maaaring mapayaman sa 5-10% carbon dioxide. Suriin ang mga kultura nang dalawang beses sa isang linggo hanggang lumitaw ang mga kolonya.

Kapag ang sample ay nasisipsip, ang mga takip ay masikip. Ang maximum na oras ng pagpapapisa ng itlog ay 8 linggo, kung pagkatapos ng oras na ito walang paglaki, iniulat na negatibo.

QA

Ang mga sumusunod na mga strain ay maaaring magamit bilang control control:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Crocyptococcus pygenes ATCC 19615

Inaasahan ang mahusay na pag-unlad para sa unang tatlong species na nabanggit, para sa paglaki ng M. fortuitum ay dapat na mabuti, habang para sa M. bovis kaunti o walang pag-unlad ay inaasahan. Samantala, ang mga species maliban sa genus na Mycobacterium ay dapat na ganap na mapigilan.

Mga Limitasyon

Ang handa na daluyan ay dapat maprotektahan mula sa ilaw, matagal na pagkakalantad sa ilaw ang nagiging sanhi ng medium upang lumiko mula sa berde hanggang asul, sa kasong ito ay hindi na magagamit ang medium. Ito ay dahil ang malachite green ay photosensitive.

Ang daluyan, dahil naglalaman ito ng mga itlog, ay madaling mahawahan kung hindi hawakan ng aseptically. Maaari itong matunaw kung ito ay nahawahan ng mga bacteria na proteolytic.

Ang paglilinang at paghawak ng mga bakterya ng genus na Mycobacterium ay nangangailangan ng mga kwalipikadong tauhan, na may kamalayan sa mga hakbang na biosafety na dapat sundin upang maiwasan na mahawahan o mahawahan ng iba.

Ang HCl ay hindi dapat gamitin sa hakbang sa neutralisasyon dahil sa pagbuo ng sodium chloride, na maaaring maging nakakalason sa bacillus ni Koch.

Ang mga halimbawa ay dapat panatilihing palamig at protektado mula sa ilaw habang hindi naproseso.

Sanggunian

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen piniling daluyan. Magagamit sa: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Daluyan ng Löwenstein-Jensen. Magagamit sa: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Magagamit sa: foodsafety.neogen.com.
4. "Daluyan ng Löwenstein-Jensen." Wikipedia, Ang Malayang Encyclopedia. 20 Nov 2018, 15:15 UTC. 24 Abril 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiological Diagnosis. Ika-5 ed. Editoryal Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis ng Bailey at Scott Microbiological. 12 ed. Editoryal Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Mga pagsubok sa biochemical para sa pagkilala ng mga bakterya na kahalagahan ng klinikal. 3rd ed. Editoryal Panamericana. Buenos Aires. Argentina.