GRAM STAIN: MAKATUWIRAN, MATERYALES, PAMAMARAAN AT PAGGAMIT - BIOLOGY - 2026

Ang mantika ng Gram ay ang pinakasimpleng at pinaka kapaki-pakinabang na pamamaraan ng paglamlam sa diagnostic microbiology. Ang pamamaraan na ito ay nilikha ng doktor ng Denmark na si Hans Christian Gram noong 1884, na pinamamahalaan ang pag-uuri ng bakterya bilang positibo sa Gram at negatibo ang Gram, ayon sa komposisyon ng cell wall.

Ang pamamaraan ay sumailalim sa ilang mga pagbabago sa pamamagitan ng Hucker noong 1921 upang patatagin ang mga reagents at pagbutihin ang kalidad ng paglamlam, na ang dahilan kung bakit ang mantsa ng Gram ay kilala rin bilang Gram-Hucker.

Iba't ibang mga smears na may mantsa ng Gram stain. A. Gram positibong cocci. B. Gram na negatibong pamalo. C. Gram-positibo, polymorphonuclear at mononuclear bacilli. D. Mga Lebadura.

Sa pamamaraang ito posible ring obserbahan ang hugis ng mga microorganism, iyon ay, kung ang mga ito ay cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorphic, filamentous, bukod sa iba pa. Pati na rin ang pamamahagi nito sa espasyo: sa isang kumpol, sa isang chain, ihiwalay, sa mga pares, sa mga tetrads, atbp.

Kapag ang isang impeksyong bakterya ay pinaghihinalaang, ang karamihan sa mga sample na natanggap ay dapat na smeared sa isang slide at Gram stained para sa mikroskopikong pagsusuri.

Ang ulat ng Gram ay gagabay sa doktor sa kung anong uri ng microorganism ang maaaring maging sanhi ng impeksyon, bago makuha ang huling resulta ng kultura.

Sa ilang mga kaso ang buhay ng pasyente ay napaka-kompromiso, samakatuwid ang mga doktor ay agarang kailangan ng ulat ng Gram upang maglagay ng isang empirical na paggamot, habang hinihintay nila ang pagkakakilanlan ng microorganism.

Halimbawa, kung ipinahayag ng Gram na mayroong mga Gram na positibong cocci sa cerebrospinal fluid, gagabayan ng doktor ang paunang therapy sa mga antibiotics na nag-aalis ng ganitong uri ng bakterya, ayon sa mga protocol na itinatag para dito.

Sa sandaling dumating ang pangwakas na resulta kasama ang pangalan ng nakahiwalay na microorganism at ang kani-kanilang mga antibiogram, susuriin ng doktor kung babaguhin o hindi ang pagbabago sa therapy. Ang pagpapasyang ito ay gagawin ayon sa pag-aaral ng pagkamaramdamin ng microorganism sa mga antibiotics na natatanggap niya at ang ebolusyon ng pasyente.

Batayan

Ito ay isang pamamaraan na mayroong 4 pangunahing mga hakbang: paglamlam, pag-aayos ng mordant, pagkawalan ng kulay at counterstain. Samakatuwid, ang pamamaraan na ito, bilang karagdagan sa pangkulay ng mga bakterya, ay nagbibigay-daan sa kanila na magkakaiba.

Ang Crystal violet ay ang unang kulay na ginamit. Mayroon itong isang kaakibat para sa peptidoglycan at makulayan ang lahat ng mga bakteryang naroroon na lila, pagkatapos ay inilalagay ang lugol, na kumikilos bilang isang mordant, iyon ay, mapipigilan ang pagbuo ng mga hindi malulutas na kristal na violet-iodine complex - ribonuclear protein sa loob ng cell. .

Gram positibong bakterya, pagkakaroon ng isang makapal na pader ng peptidoglycan, ay bumubuo ng higit pang mga kumplikado (crystal violet-iodine), samakatuwid pinapanatili nila ang pangulay.

Bilang karagdagan, naiimpluwensyahan din nito na ang pader ng positibong bakterya ng Gram ay naglalaman ng isang mas malaking halaga ng mga unsaturated acid, na nagpapakita ng mahusay na pagkakaugnay sa mga ahente ng oxidizing (Lugol).

Samantala, ang mga negatibong bakterya ng Gram ay may isang manipis na layer ng peptidoglycan, na nagiging sanhi ng mga bakterya na bumubuo ng mas kaunting mga kumplikado kaysa sa mga positibong Gram.

Pagkatapos ay darating ang hakbang na pagkawalan ng kulay, kung saan positibo ang Gram at negatibong bakterya ng Gram.

Ang mga negatibong bakterya ng Gram ay naglalaman ng isang panlabas na lamad na mayaman sa lipopolysaccharides na bahagi ng kanilang cell wall. Ang mga taba ay nawasak sa pamamagitan ng pakikipag-ugnay sa alkohol na acetone, kaya ang panlabas na lamad ay nagiging maligaya, na naglalabas ng crystal na violet.

Ito ay kung paano ito pagkatapos ay kontra sa safranin o pangunahing fuchsin, nagiging pula.

Sa kaso ng mga positibong bakterya ng Gram, nilalabanan nila ang pagkalanta dahil gumagana ang pagpapaputi sa pamamagitan ng pagsasara ng mga pores, pinipigilan ang kristal na violet / yodo na kumplikado mula sa paglabas.

Samakatuwid, ang kulay sa kristal na violet ay nananatiling matatag, at walang silid para sa safranin o fuchsin. Ito ang dahilan kung bakit ang mga bakteryang ito ay namantsahan ng malalim na asul o lila.

materyales

Ang set ng paglamlam ng Gram ay binubuo ng:

• Violet glass
• Lugol
• Acetone alkohol
• Safranin o pangunahing fuchsin

Paghahanda ng mga tina at reagents

Solusyon sa lila ng Crystal

Solusyon sa:

Violet crystal ------------- 2 gr

Ethyl alkohol 95% ----------- 20cc

Solusyon B:

Ammonium oxalate ----------- 0.8 gr

Natunaw na tubig ------------- 80 cc

Para sa pangwakas na paghahanda ng kristal na lila, ang solusyon A ay dapat na lasaw ng 1:10 na may distilled na tubig at halo-halong may 4 na bahagi ng solusyon B. Ang pinaghalong ay nakaimbak ng 24 na oras bago gamitin. I-filter sa isang bote ng amber staining gamit ang filter paper.

Ang halagang gagamitin araw-araw ay ililipat sa isang bote ng amber dropper.

Iodo-Lugol

Timbang at sukatin ang ipinahiwatig na halaga ng bawat tambalan, tulad ng sumusunod:

Mga kristal ng Iodine ------------- 1gr

Potasa iodide ------------- 2gr

Natunaw na tubig ------------- 300 cc

Ang potassium yodo ay unti-unting nalulusaw sa tubig at pagkatapos ay idinagdag ang yodo. Ang solusyon ay na-ahit sa isang bote ng ambar.

Ang halagang gagamitin araw-araw ay ililipat sa isang mas maliit na bote ng amber na may isang dropper.

Pagdurugo

95% Alkohol ng Ethyl ------------ 50 ml

Acetone ------------------ 50 ml

Inihanda ito sa pantay na mga bahagi. Takpan nang maayos, dahil may posibilidad na sumingaw.

Ilagay sa isang bote ng dropper.

Ang paghahanda na ito ay nagbibigay ng isang pagkawalan ng kulay sa katamtamang oras 5-10 segundo at ito ang pinaka inirerekomenda.

Mas gusto ng mga nagsisimula na gumamit lamang ng 95% na ethyl alkohol, kung saan ang pagkupas ay mas mabagal kaysa 10 hanggang 30 segundo.

Habang ang mas may karanasan ay maaaring gumamit ng purong acetone, kung saan ang pagkawalan ng kulay ay nangyayari nang mabilis mula 1 hanggang 5 segundo.

Pag-iiba

Safranin Stock Solution

Safranina -------------- 2.5 gr

Ethyl alkohol 95% --------- 100 cc

Matapos timbangin ang ipinahiwatig na halaga ng safranin, natunaw ito sa 100 ml ng 95% na etil na alkohol.

Ang gumaganang solusyon sa safranin ay inihanda mula sa solusyon sa stock.

Upang gawin ito, sukatin ang 10 cc ng solusyon sa stock, magdagdag ng 90 cc ng distilled water upang makagawa ng 100 ml.

Inirerekomenda na ilipat ang halaga na gagamitin araw-araw sa isang bote ng amber na may isang dropper.

Ang mga mikroorganismo na mahina ang negatibong Gram na negatibo sa mantsa ng Gram-Hucker, tulad ng ilang anaerobes, Legionella sp, Campylobacter sp, at Brucella sp, ay maaaring mantsang mas mahusay na gamit ang pagbabago ng Kopeloff ng Gram-Hucker stain. na tinatawag na Gram-Kopeloff mantsang.

Ang pamamaraan na ito ay nagbabago ng safranin dye sa pangunahing fuchsin. Sa modipikasyong ito posible na epektibong kulayan ang nabanggit na mga microorganism.

Muling pag-iimbak

Ang mga handa na kulay ay dapat na naka-imbak sa temperatura ng kuwarto.

Paghahanda ng pahid ng sampol na kulay

Ang isang sample ay dapat maglaman ng hindi bababa sa 10 ⁵ microorganism bago ang pagmamasid sa microorganism sa isang smear ay malamang. Ang mga smear ay maaaring gawin mula sa direktang sample o mula sa mga kultura sa solid o liquid media.

Ang mga smear ay dapat na pantay-pantay, maayos na ipinamamahagi at hindi masyadong makapal, para sa isang mas mahusay na paggunita ng mga istruktura na naroroon.

-Gram ng mga direktang halimbawa

Gram ng uncentrifuged ihi

Ang ihi ay halo-halong at 10 µl ay inilalagay sa isang slide. Ang pagmamasid ng hindi bababa sa isang bakterya / Dip na patlang ay nagpapahiwatig na mayroong impeksyon.

Nangangahulugan ito na ang kultura ay magkakaroon ng humigit-kumulang sa 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) ng ihi sa 85% ng mga kaso.

Ang pamamaraan na ito ay hindi kapaki-pakinabang para sa mga kolonya na nabibilang sa ibaba 100,000 CFU.

CSF Gram

Ang CSF ay dapat na sentripuged, tinanggal ang supernatant, at kumalat ang pellet sa isang slide. Ang likido na ito ay sterile sa ilalim ng normal na mga kondisyon; ang pagmamasid sa bakterya ay nagpapahiwatig ng impeksyon.

Gram ng mga sample ng paghinga

Ang sputum Gram, bronchial o bronchoalveolar lavage, bagaman maaaring mayroong iba't ibang mga microorganism, ay palaging gagabay sa diagnosis, bilang karagdagan sa pagiging kapaki-pakinabang sa uri ng mga cell na sinusunod.

Sa kaso ng dura, ang smear ay dapat ihanda kasama ang pinaka purulent na bahagi ng sample.

Gram ng dumi ng tao

Hindi inirerekumenda na magsagawa ng Gram sa ganitong uri ng mga sample, dahil wala itong halaga ng diagnostic.

-Gram ng mga pananim

Maaari silang gawin sa dalawang paraan, ang isa mula sa likidong kultura at ang iba pa mula sa mga solidong kultura.

Mga kulturang likido

Mula sa likidong kultura ito ay napaka-simple; Ang ilang mga roasts ng maulap na sabaw ay kinuha sa ilalim ng burner at inilagay sa isang malinis at tuyo na slide, na ginagawang mga pabilog na paggalaw mula sa gitna patungo sa periphery, upang ipamahagi ang materyal nang pantay.

Hayaan itong matuyo nang kusang sa hangin. Kapag tuyo, ang materyal ay naayos sa sheet na may init. Upang gawin ito, sa tulong ng isang sipit, ang sheet ay naipasa ng 3 hanggang 4 na beses sa pamamagitan ng siga ng burner ng Bunsen, pag-aalaga na huwag sunugin ang materyal.

Ang sheet ay pinapayagan na palamig at inilalagay sa pangkulay na tulay.

Solid na pananim

Upang magsagawa ng isang pahid para sa mantsa ng Gram mula sa isang solidong kultura, magpatuloy tulad ng sumusunod:

Bago piliin ang mga kolonya na dapat makuha, dapat na ihanda ang slide, paglalagay ng humigit-kumulang dalawang patak ng solusyon sa sterile na physiological saline.

Kung ang orihinal na plate ng kultura ay naglalaman ng maraming iba't ibang mga uri ng mga kolonya, ang isang nakahiwalay na kolonya ng bawat isa ay pipiliin upang maisagawa ang Gram. Ang bawat kolonya ay dadalhin kasama ang platinum loop upang matunaw sa solusyon ng asin na dati nang inilagay sa slide.

Ang mga paggalaw ng pabilog ay ginawa mula sa sentro patungo sa periphery, upang homogenous na ipamahagi ang kolonya sa slide.

Hayaan itong matuyo nang kusang sa hangin. Sa sandaling tuyo, ang sheet ay naayos na may init, tulad ng ipinaliwanag dati (sa pamamagitan ng flaming slide sa mas magaan), pag-aalaga na huwag sunugin ang materyal.

Ang pamamaraang ito ay dapat gawin sa bawat magkakaibang uri ng kolonya. Sa isang piraso ng papel, ang pagkakasunud-sunod ng kung ano ang sinusunod ay dapat tandaan, halimbawa:

Colony 1: Beta-haemolytic dilaw na kolonya: Gram positibong cocci ay sinusunod sa mga kumpol

Colony 2: Kulay na may kulay na krimen, nang walang hemolysis: Ang negatibong negatibong coccobacilli ay sinusunod.

Ang bawat slide ay dapat na may label na malaman kung ano ang ating sinusubaybayan.

Teknik

Ang pamamaraan ng paglamlam ng Gram ay napakadali upang maisagawa at medyo mura at hindi makaligtaan sa isang laboratoryo ng microbiology.

Ginagawa ito tulad ng mga sumusunod:

1. Ayusin ang smear na may init at lugar sa paglamlam ng tulay.
2. Takpan ang slide nang buo sa kristal na lila na 1 minuto.
3. Hugasan ng tubig Huwag matuyo
4. Takpan ang sheet na may solusyon ng lugol, iwanan upang kumilos ng 1 minuto. Hugasan ng tubig Huwag matuyo.
5. Pagdurugo para sa 5-10 segundo na may banayad na pagyanig sa alkohol acetone. O kaya, ilagay ang sheet sa isang patayong posisyon at i-drop ang mga patak ng decolorizer sa ibabaw hanggang maalis ang labis ng hindi nababangong baso na lila. Huwag lumampas.
6. Hugasan ng tubig Huwag matuyo.
7. Palitan ang slide sa paglamlam ng tulay at takpan ng 30 seg sa safranin (Gram-Hucker) o 1 min na may pangunahing fuchsin (Gram-Kopeloff).
8. Hugasan ng tubig
9. Hayaan itong mai-dry nang walang kusang sa isang tuwid na posisyon.

Kapag tuyo, ilagay ang 1 patak ng langis ng paglulubog upang obserbahan ito sa ilalim ng layunin ng 100X sa light mikroskopyo.

Kagamitan

Ang pamamaraan na ito ay nagbibigay-daan upang makilala ang mga pagkakaiba-iba ng morphotintorial ng karamihan sa mga bakterya.

Ang mga lebadura ay nakikilala din sa kulay na ito. Kinukuha nila ang kristal na violet, iyon ay, sila ay namantsahan ng positibong Gram.

Sa kabilang dako, ang spore-form na Gram-positibong bacilli ay maaaring makilala, kung saan ang isang malinaw na puwang ay sinusunod sa loob ng bacillus, kung saan nabuo ang endospore, kahit na ang mga spores ay hindi marumi. Ang iba pang mga pamamaraan tulad ng Shaeffer-Fulton ay ginagamit upang mantsang mga spores.

Dapat pansinin na ang paglamlam na ito ay hindi ginagamit upang kulayan ang lahat ng mga uri ng bakterya, iyon ay, may mga kaso kung saan hindi gumana ang paglamlam.

Sa kasong ito ang bakterya na kulang ng isang cell pader ay maaaring mabanggit. Halimbawa: genus Mycoplasma, spheroplast, ureaplasma, L-form at protoplast.

Nagtataglay din ito ng napakasamang bakterya na may mga pader na mayaman sa mycolic acid, tulad ng Mycobacteria, at intracellular bacteria tulad ng Chlamydias at Rickettsias.

Hindi rin ito epektibo sa paglamlam ng karamihan sa bakterya ng spirochetal.

Mayroong bakterya ng parehong genus na maaaring sundin sa parehong sample tulad ng Gram na positibo at negatibo ang Gram. Kapag nangyari ito ay tinatawag itong variable Gram stain, na maaaring sanhi ng pagbabago sa mga sustansya, temperatura, pH o konsentrasyon ng electrolyte.

Mga karaniwang pagkakamali

Pinasadyang pagpapaputi

Ang pagmamalabis sa hakbang na pagkawalan ng kulay ay maaaring humantong sa pag-obserba ng mga maling negatibong microorganismo ng Gram.

Hindi naghihintay ng mahabang oras ng pagpapatayo upang idagdag ang langis sa paglulubog

Maaari itong maging sanhi ng positibong bakterya ng Gram na mantsang negatibo ang Gram (maling Gram na negatibo). Nangyayari ito dahil sa mga dating kultura ay malamang na patay o nasira ang bakterya at sa ilalim ng mga kundisyong ito ang bakterya ay hindi nagpapanatili ng crystal violet.

Gumamit ng napakalumang solusyon ng lugol:

Sa paglipas ng panahon ang lugol ay nawawala ang mga katangian nito at nawawala ang kulay nito. Kung ang na-degenerated reagent ay ginagamit, hindi ito ayusin ang kristal na violet nang maayos, samakatuwid mayroong posibilidad na makakuha ng isang paggunita ng maling mga Gram na negatibong microorganism.

Asul na background

Ang isang maayos na background na may kulay ay magiging pula. Ang isang asul na background ay nagpapahiwatig na ang pagkawalan ng kulay ay hindi sapat.

Mga Sanggunian

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medikal Microbiology, ika-6 na edisyon McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiological Diagnosis. (Ika-5 ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editoryal Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Pangkalahatang Mycology. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
5. "Gram stain." Wikipedia, Ang Malayang Encyclopedia. 4 Oktubre 2018, 23:40 UTC. 9 Dis 2018, 17:11. Kinuha mula sa es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manwal ng Medikal Microbiology. Ika-2 edisyon, Venezuela: Direktor ng media at mga publikasyon ng Unibersidad ng Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pangunahing mga mantsa sa laboratoryo ng microbiology. Pananaliksik sa Kapansanan. 2014; 3 (1): 10-18.