PAGSUNUD-SUNOD NG DNA: MAXAM-GILBERT, PAMAMARAAN AT HALIMBAWA - BIOLOGY - 2025

Ang pagkakasunud-sunod ng DNA (deoxyribonucleic acid) ay isang pamamaraan sa mga molekular na biology laboratories na nagbibigay - daan upang malaman ang pagkakasunud-sunod ng mga nucleotides sa genetic na materyal ng interes. Bukod dito, ang pagkakasunud-sunod ng RNA (ribonucleic acid) ay maaari ring ibunyag.

Ang pamamaraan na ito ay kailangang-kailangan para sa pag-unlad ng biological science. Naaangkop din ito sa iba pang larangan ng kaalaman - tulad ng diagnosis ng medikal at forensic investigations, halimbawa.

Pinagmulan: pixabay.com

Noong nakaraan, ang pagkakasunud-sunod ng isang strand ng DNA ay itinuturing na isang mabagal at mamahaling aktibidad, na pinapayagan ang pagkakakilanlan ng ilang mga pares na base sa oligonucleotides.

Ngayon, sa lahat ng mga pagsulong sa agham, ang pag-uutos ng DNA ay isang regular na operasyon sa maraming mga laboratoryo sa buong mundo salamat sa kontribusyon ng halos 50 taon ng pananaliksik sa larangan na ito. Sa mga tuntunin ng haba ng kadena, hanggang sa milyon-milyong mga pares ng base ay maaaring sunud-sunod sa isang napakaikling panahon.

Upang gawin ito, mayroong dose-dosenang mga pamamaraan na binuo na nag-iiba sa presyo at katumpakan. Sa artikulong ito, ilalarawan namin ang parehong klasikal at modernong mga pamamaraan, ang bawat isa ay may mga pakinabang at kawalan nito.

Hanggang ngayon, pinapayagan ng pagkakasunud-sunod na mga diskarte ang pagkuha ng pagkakasunud-sunod ng kumpletong genom, mula sa maliit na prokaryote at lebadura hanggang sa genome ng tao.

Istraktura ng DNA

Upang maunawaan ang mga pamamaraan at pamamaraan na ginamit para sa pagkakasunud-sunod ng DNA, kinakailangan upang malaman ang ilang mga pangunahing aspeto ng istraktura at komposisyon ng molekula.

Ang DNA ay isang biomolecule na matatagpuan sa lahat ng mga nabubuhay na bagay, mula sa bakterya hanggang sa malalaking hayop sa tubig-dagat. Ang mga organelles - tulad ng mitochondria at chloroplast - ay may isang pabilog na molekula ng DNA sa loob nila. Kahit na sa ilang mga virus, ang genetic material na natagpuan ay DNA.

Sa istruktura, ang DNA ay isang koleksyon ng mga nucleotide. Ang bawat isa ay binubuo ng isang karbohidrat, isang nitrogenous base (A, T, C o G) at isang pangkat na pospeyt. Ang layunin ng pagkakasunud-sunod ng DNA ay upang ipakita ang pagkakasunud-sunod kung saan ang apat na mga nitrogenous na mga base ay matatagpuan sa pagkakasunud-sunod.

Kasaysayan

Noong kalagitnaan ng 1950s, inilarawan ng mga mananaliksik na Watson at Crick ang istraktura ng DNA gamit ang mga pamamaraan ng christolographic. Gayunpaman, wala sa mga mananaliksik na ito ang nakakahanap ng isang paraan upang malutas ang pagkakasunud-sunod.

Bagaman mayroong ilang mga nauna, ang pinakamahalagang kaganapan ay ang paglikha ng pamamaraan ng Sanger, noong 1977. Si Frederick Sanger, ang ama ng pamamaraan, ay isang biochemist ng British, nagwagi ng dalawang mga premyo ng Nobel para sa kanyang napakalaking kontribusyon sa mga biological science.

Ang pamamaraan na ito ay kilala rin sa panitikan bilang "chain termination" o dideoxynucleotides. Ang mga prinsipyo ng pamamaraang ito at yaong nabuo batay sa pagpapabuti at pagbabago nito ay ilalarawan sa ibaba.

Paraan ng panganib

Ang pag-unlad ng pamamaraan ng Sanger ay kumakatawan sa isang mahalagang kaganapan sa molekular na biyolohiya. Ito ay nagsasangkot sa mga pangunahing sangkap ng proseso ng pagtitiklop ng DNA na karaniwang nangyayari sa cell, ngunit nagdaragdag ng isang espesyal na sangkap: dideoxynucleotides.

Pangunahing sangkap ng reaksyon

- DNA polymerase: ang DNA polymerase enzyme ay isang mahalagang elemento ng proseso. Ang molekulang ito ay nakikilahok sa pagtitiklop ng strand ng DNA at ang papel nito ay ang synthesis ng bagong strand, na ipinapares ang triphosphate deoxyribonucleotides kasama ang mga pantulong na.

Alalahanin na sa DNA, ang pares ng thymines (T) na may adenines (A) sa pamamagitan ng dalawang mga bono ng hydrogen, habang ginagawa ng cytosine (C) sa guanine (G) sa pamamagitan ng tatlong bono.

- Nukleotides: Ang pagkakasunud-sunod ng Sanger ay nagsasangkot ng dalawang uri ng mga nucleotides, ang apat na 2'-deoxynucleotides (pinaikling bilang dATP, dGTP, dCTP at dTTP) at ang apat na dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP at ddTTP).

Bagaman ang mga dideoxynucleotides ay katulad ng mga monomer na karaniwang nakasama sa DNA, kulang sila ng isang -OH group sa kanilang istraktura. Ginagawa nitong imposible na magdagdag ng isang bagong nucleotide sa kadena.

Samakatuwid, kapag ang isang espesyal na nucleotide ay idinagdag - sa isang ganap na random na paraan - sa chain sa pagbuo, ang synthesis ay paralisado. Kaya, sa pagtatapos ng reaksyon, may mga kadena ng iba't ibang laki, bawat isa kung saan ang reaksyon ay tumigil sa ibang punto.

Eksperimento, apat na mga pagsubok ang inihanda. Ang bawat isa ay naglalaman ng DNA na nakuha mula sa biological sample ng interes, ang normal na nucleotide, at isa sa apat na espesyal na mga uri ng nucleotide. Alinman sa mga espesyal na nucleotide ay minarkahan ng ilang uri ng fluorescent marker (tingnan ang awtomatikong pagkakasunud-sunod sa ibaba).

Pagbasa ng mga resulta

Ang unang hakbang ay upang paghiwalayin ang bawat isa sa mga synthesized chain ayon sa kanilang laki. Ang ilan ay mas mahaba kaysa sa iba, depende sa kung saan isinama ang mga espesyal na base.

Mayroong iba't ibang mga pamamaraan ng biochemical na nagpapahintulot sa paghihiwalay ng mga sangkap ng isang halo na gumagamit ng sukat bilang isang pag-aari ng diskriminasyon. Sa pamamaraan ng Sanger, ang iba't ibang mga tanikala ay pinaghihiwalay ng mga electrophoresis. Sa mas sopistikadong mga variant ng pamamaraan, ginagamit ang capillary electrophoresis.

Kaya, ang mas mahahabang strands ay naglalakbay nang mas kaunti kaysa sa mas maiikling mga variant. Ang sistemang ito ay pagkatapos ay dumadaan sa isang mambabasa na kinikilala ang marker na kasama sa bawat dideoxynucleotide. Sa ganitong paraan, malalaman ang pagkakasunud-sunod ng pagkakasunud-sunod.

Ang pamamaraang "unang henerasyon" na ito ay may kakayahang magbasa ng mga fragment ng DNA na hindi hihigit sa 1 kilobase. Sa kasalukuyan, ang pamamaraan ng Sanger ay ginagamit sa iba't ibang mga laboratoryo, sa pangkalahatan sa mga modernong variant nito. Bilang karagdagan, ginagamit ito upang i-corroborate ang mga resulta na nakuha gamit ang pinaka kumplikadong pamamaraan - ngunit hindi gaanong tumpak.

Awtomatikong pagkakasunud-sunod

Kapag kinakailangan ang malakihang pagkakasunud-sunod, ang proseso ay pinabilis sa pamamagitan ng automation. Ito ay isang pagkakaiba-iba ng paraan ng pagtatapos ng chain ng Sanger, kung saan ang mga panimulang aklat ay may label na may mga produktong fluorescent upang makilala ang mga ito.

Kasunod nito, ang produkto ng reaksyon ay pinapatakbo sa isang electrophoresis - lahat sa isang solong linya. Habang ang bawat fragment ay lumabas sa huling bahagi ng gel, mabilis itong nakilala sa pamamagitan ng pag-label nito ng fluorescent, na may isang error na nakapalibot sa 1%.

Ang pinaka sopistikadong mga sistema ay may isang sistema ng hanggang sa 96 na mga capillary tubes na pinamamahalaan ng isang computer na kaisa sa isang robot. Iyon ay, 96 mga halimbawa ng DNA ay maaaring subukan nang sabay-sabay. Kaya, ang proseso na kinasasangkutan ng electrophoresis at pagsusuri ng mga resulta ay ganap na awtomatiko.

Sa isang araw, ang mga sistemang ito ay maaaring magkakasunod hanggang sa 550,000 mga base. Sa panahon ng proseso, ang paggawa ng tao ay hindi kinakailangan, tatagal lamang ng 15 minuto upang simulan ang pamamaraan.

Pagsunod-sunod ng Maxam-Gilbert

Sa parehong oras na inilathala ni Sanger ang kanyang gawain, dalawang mananaliksik na nagngangalang Allan Maxan at Walter Gilbert ay nagtagumpay sa pagbuo ng isa pang pamamaraan upang makuha ang pagkakasunud-sunod ng DNA. Ang pamamaraan ay nakakuha ng katanyagan sa oras, ngunit sa kalaunan ay inilipat sa pamamagitan ng pagpapabuti ng pamamaraan ng Sanger.

Taliwas sa pamamaraan ng Sanger, ang pagkakasunud-sunod ng Maxan at Gilbert (o pagkakasunud-sunod ng kemikal, tulad ng alam din) ay hindi nagsasangkot ng mga reaksyon ng hybridization. Ang pamamaraan ay binubuo ng label na may mga reaktibo na ahente sa isang dulo, na sinusundan ng proseso ng paglilinis.

Ang isa sa mga negatibong aspeto ng pamamaraang ito ay namamalagi sa napakalaking pagiging kumplikado at sa paggamit ng mga kemikal na mapanganib para sa gumagamit. Ang mga kemikal na pahinga ay sapilitan ng aplikasyon ng DMS, formic acid, hydrazine, at hydrazine na may mga asing-gamot.

Proseso

Ang protocol ay nagsisimula sa pag-label sa 5 'dulo ng strand na may marker ng posporus 32, kung gayon ang isang pagbabago ng kemikal ng nitrogen base ay nangyayari at ito ay pinaghiwalay. Sa wakas, nangyayari ang cleavage ng abasic region.

Una mong paikliin ang string na nais mong mag-order sa mas maliit na mga segment. Ang hakbang na ito ay isinasagawa na may mga paghihigpit na mga enzyme, na nagreresulta sa mga pagtatapos ng nakausli.

Susunod, ang reaksyon ay isinasagawa gamit ang isang alkalina na phosphatase, ang layunin kung saan ay upang maalis ang pangkat na pospeyt. Kaya, ang isang polynucleotide kinase ay maaaring magamit upang maisagawa ang label.

Ang chain ay denatured (nakabukas ang dalawang strands). Pagkatapos ay inilapat ang mga kemikal. Ang mga reaksyon ng cleavage na ito ay ginagawa sa isang kinokontrol na paraan at kilala kung anong mga uri ng mga bono ang bawat inilapat na mga break sa kemikal.

Pagbasa ng mga resulta

Tulad ng sa pamamaraan ng Sanger, ang pagbabasa ng mga resulta ay nagsasangkot ng paghihiwalay sa pamamagitan ng laki ng mga tanikala na nakuha sa isang sistema ng electrophoresis. Ang mga system na binubuo ng polyacrylamide ay nagbibigay-daan sa isang sapat na resolusyon na makuha para sa pagbabasa ng gel.

Pagsunod-sunod ng masa

Ang napakalaking pagkakasunud-sunod ay sumasaklaw sa isang serye ng mga pamamaraan ng nobela, pinaikling bilang NGS, mula sa Ingles na "Next Generation Sequencing".

Ang mga pamamaraan na inuri bilang NGS ay nangangailangan ng isang nakaraang hakbang ng pagpapalakas ng DNA (hindi sila gumana sa isang solong molekula). Bukod dito, ang mga platform na ginamit ay nag-iiba nang malawak. Ang mga prinsipyo ng pinakapopular na pamamaraan ay ilalarawan sa ibaba:

Pyrosequencing

Nagsasangkot ito sa pagsubaybay sa pagpapalabas ng isang pyrophosphate, na nangyayari sa tuwing ang isang bagong nucleotide ay idinagdag sa strand ng DNA. Ang isang sistema ng mga enzyme ay kaisa, upang ang paglabas ng ilaw (na nakikita ng isang camera) ay nangyayari tuwing ang isang bagong nucleotide ay isinasama.

Ang proseso ay nagsisimula sa magkakahiwalay na pagpapapisa ng bawat base ng nitrogen upang mapatunayan kung mayroong ilaw na paglabas o hindi. Maaaring mabasa ng pyrosequencing ang mahabang strands, ngunit ang error rate na natagpuan ay mataas.

Pagkakasunud-sunod ng synthesis

Ito ay nagsasangkot sa pagsasama ng mga may label na mga nucleotides. Ang mga sangkap na fluorescent na ito ay idinagdag, hugasan, at ang nakasama na nucleotide ay nabanggit. Pagkatapos, ang label ng nucleotide ay tinanggal, at ang synthesis ng strand ay maaaring magpatuloy. Sa susunod na hakbang, ang isang may label na nucleotide ay isasama rin, at ang mga nabanggit na mga hakbang ay maulit.

Ang isang disbentaha sa pamamaraang ito ay nangyayari kapag ang mga fluorescent marker ay hindi ganap na tinanggal. Ang mga emisyon na ito ay lumikha ng mga error sa background, na nagreresulta sa mga makabuluhang error.

Pagkakasunud-sunod ng Ligation

Ang pamamaraan na ito ay naiiba sa iba, dahil hindi ito gumagamit ng DNA polymerase. Sa halip, ang pangunahing enzyme para sa pamamaraang ito ay ligase. Dito, ang mga fluorescently na may label na mga fragment ng DNA ay ginagamit, naka-link ito ng enzyme at napansin ito.

Ang pinakamalaking problema sa pamamaraang ito ay ang maikling haba ng fragment na may kakayahang maproseso.

Pagkakasunud-sunod ng Ion Torrent

Ang pamamaraan na ito ay batay sa pagsukat ng H ⁺ ion na pinapalabas sa tuwing ang isang bagong nucleotide ay isinasama. Ang prinsipyo ay halos kapareho sa pyrosequencing, ngunit mas mura.

Mga halimbawa

Ang pagkakasunud-sunod ng genome ng tao

Ang pagkakasakop sa genome ng tao ay isa sa pinakahihintay na mga hamon sa biology, pati na rin ang pagiging isa sa mga pinaka-kilalang mga karibal sa kasaysayan ng agham. Sa katunayan, para sa mga siyentipiko na kasangkot sa proyekto, ang pagkakasunud-sunod ng genome ay naging isang kumpetisyon.

Noong 1990 sinimulan niya ang tinatawag na "human genome project", pinangunahan ng sikat na siyentipiko, nagwagi ng Nobel Prize, James Watson. Matapos ang isang taon, noong 1991, sinubukan ng Venter ang hamon ng "beating" Watson at pagsunud-sunod sa genome sa harap niya. Gayunpaman, noong 1992, nagretiro si Watson at ang utos ay kinuha ng isa pang mananaliksik.

Noong 1995 inihayag ni Venter ang kanyang tagumpay sa kumpletong pagkakasunud-sunod ng isang bacterial genome sa pamamagitan ng random na pamamaraan ng pagkakasunud-sunod. Katulad nito, inihayag ng magkontra koponan ng isang taon mamaya ang pagkakasunud-sunod ng genastong genome.

Noong 2000, natapos ang degree. Ang parehong mga kumpanya ay nai-publish ang kanilang paunang buong genome na mga resulta sa dalawa sa mga pinaka-prestihiyosong journal ng agham: Kalikasan at Agham.

Gayunpaman, ang mga siyentipiko ay patuloy na nagtatrabaho sa pagpapabuti ng mga panukala, at noong 2006 ang mga pagkakasunud-sunod ng ilang mga kromosoma ng tao ay nakumpleto.

Kahalagahan at aplikasyon

Ang pag-alam ng pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide ng tulad ng isang mahalagang molekula tulad ng DNA ay mahalaga sa mga biologist at mga nauugnay na propesyonal. Ang kadena ng polynucleotides na ito ay naglalaman ng lahat ng impormasyong kinakailangan para sa pagpapaunlad at pagpapanatili ng lahat ng mga anyo ng buhay.

Para sa mga kadahilanang ito, ang kaalaman sa pagkakasunud-sunod na ito ay mahalaga para sa biological na pananaliksik. Sa panimula, ang pagkakasunud-sunod ay ginagawang posible upang masukat ang isa sa mga pinakamahalagang katangian ng mga biological system at upang maitaguyod ang mga pagkakaiba sa pagitan nila.

Ang sequencing ay malawakang ginagamit ng mga taxonomist at systematist, dahil ang ilang mga pagkakasunud-sunod sa DNA ay ginagawang posible upang maitaguyod ang mga pamantayan upang tapusin kung mayroon man o hindi ang dalawang mga organismo na kabilang sa parehong mga species, bilang karagdagan sa kakayahang magpanukala ng mga hypotheses tungkol sa mga ugnayang phylogenetic sa pagitan nila.

Bilang karagdagan, ang pagkakasunud-sunod ng DNA ay may mga aplikasyon sa gamot at diagnostic. Halimbawa, may mga murang at naa-access na mga system na, sa pamamagitan ng pag-uuri, posible upang masuri ang pagkahilig na magkaroon ng ilang mga sakit (tulad ng cancer) gamit ang tinatawag na solong nucleotide polymorphism (SNPs).

Ang mga pagsisiyasat ng uri ng kriminal at forensic ay pinayaman din ng mga pamamaraan ng pagkakasunud-sunod, na maaaring magamit bilang maaasahang katibayan ng pakikilahok ng isang tiyak na indibidwal sa isang krimen.

Mga Sanggunian

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Ang pagkakasunud-sunod ng mga sequencers: ang kasaysayan ng pagkakasunud-sunod ng DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Ang susunod na henerasyon ng rebolusyon na sumunod at ang epekto nito sa genomics. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Mga karibal na pang-agham. Mula sa Galileo hanggang sa proyektong genome ng tao. Editoryal na Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Ang pagkakasunud-sunod ng DNA sa mga inhibitor na nagtatapos ng chain. Mga pamamaraan ng pambansang akademya ng agham, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Ang susunod na henerasyon ng pagkakasunud-sunod ay nagbabago sa biology ngayon. Mga pamamaraan ng kalikasan, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Susunod na henerasyon ng Sequencing. Caister Academic Press.