DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): MGA KATANGIAN, MAKATWIRAN, PAGGAMIT - CHEMISTRY - 2025

Ang DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ay isang pangulay sa pamamagitan ng pag-aari ng fluorescent na nagsisilbing isang marker, na malawakang ginagamit sa sining ng fluorescence microscopy o daloy ng cytometry, bukod sa iba pa. Ang pag-ilaw na inilabas nito ay maliwanag na asul, ang paggulo nito ay nangyayari sa pagitan ng 455-461 nm (UV light).

Ang dye ng DAPI ay maaaring dumaan sa cell lamad ng mga patay na cell na may kadalian. Maaari rin itong mahawakan ang nuclei ng mga buhay na selula, ngunit sa kasong ito, ang konsentrasyon nito ay dapat na mas mataas.

Ang istraktura ng kemikal ng fluorescent dye DAPI. Pinagmulan: Larawan: File: Ang DAPI.svg ay isang bersyon ng vector ng file na ito. Dapat itong magamit sa lugar ng imaheng raster na ito kung hindi mas mababa / Richard Wheeler (Zephyris) Na-edit na imahe

Ang pangulay ay may kakayahang ma-access ang cellular DNA na kung saan mayroon itong isang espesyal na kaakibat, na nagbubuklod na may malaking kasiyahan sa mga nitrogenous na adenine at thymine. Para sa kadahilanang ito ay lubos na kapaki-pakinabang sa ilang mga pamamaraan ng biyolohikal na pamamaraan.

Ang tambalang ito ay kabilang sa pangkat ng mga indole dyes at ipinakita na magkaroon ng higit na sensitivity sa DNA kaysa sa ethidium bromide at propidium iodide, lalo na sa agarose gels.

Ang paggamit ng ganitong fluorescent dye ay napakalawak, sapagkat ito ay kapaki-pakinabang para sa: pag-aaral ng mga pagbabago sa DNA sa mga apoptotic na proseso (pagkamatay ng cell) at sa gayon ay nakakakita ng mga cell sa prosesong ito; para sa larawan ng footprinting ng DNA (pag-print ng larawan ng DNA); upang pag-aralan ang kontaminasyon ng bakterya; o upang mailarawan ang pagkakabukod ng nukleyar.

Ginamit din ito sa pag-aaral ng mga chromosomal band, sa pagtuklas ng Mycoplasmas sp DNA, sa pakikipag-ugnay sa DNA-protina, sa paglamlam at pagbibilang ng mga cell sa pamamagitan ng immunofluorescence at kahit na kulayan ang mga mature na pollen grains.

katangian

Ang DAPI ay ang pagdadaglat ng pangalan ng kemikal nito (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). Ang molekular na pormula nito ay C ₁₆ H ₁₅ N _5. Ito ay may bigat na molekular ng 350.3. Malapit sa UV light range (345 hanggang 358 nm) ang maximum na paggulo ng DAPI-DNA complex ay nangyayari, habang ang maximum na pag-ilaw ng fluorescence ay nangyayari sa pagitan ng 455-461 nm.

Ang pangulay na ito ay nailalarawan bilang isang dilaw na pulbos, ngunit ang mga istruktura na minarkahan ng fluorophore na ito ay naglalabas ng isang napakatalino na asul na ilaw.

Ito ay isang compound na natutunaw sa tubig, gayunpaman, upang mapabilis ang pagkabulok nito ang ilang init ay maaaring mailapat. Maaari itong matunaw sa PBS ngunit hindi direktang matunaw dito.

Sa sandaling ihanda ang pangulay, dapat itong maiimbak sa dilim, iyon ay, protektado mula sa ilaw, sa temperatura na 2 hanggang 8 ° C (refrigerator). Sa ilalim ng mga kondisyong ito, ang pangulay ay matatag para sa higit sa 3 linggo o buwan.

Kung protektado mula sa ilaw ngunit naiwan sa temperatura ng silid ang katatagan nito ay bumaba sa 2 o 3 linggo, ngunit nakalantad sa direktang liwanag ang pagkasira ay napakabilis. Kung nais mong mag-imbak nang mas mahaba, maaari itong mapalamig sa -20 ° C na ipinamamahagi sa mga aliquots.

Batayan

Ang paglamlam na ito ay batay sa pagbuo ng isang nuclear counterstain sa pangunahing mga pamamaraan ng molekula na molekula, tulad ng: daloy ng cytometry, fluorescence mikroscopy at paglamlam ng metaphase chromosome o interphase nuclei, bukod sa iba pa.

Ang diskarteng ito ay batay sa mahusay na kaakibat na tinain ng dye para sa mga nitrogenous base (adenine at thymine) na nakapaloob sa genetic material (DNA) sa menor de edad. Habang nasa antas ng cytoplasmic, nag-iiwan ito ng napakaliit na background.

Kapag ang fluorescent dye ay nagbubuklod sa mga rehiyon ng adenine at thymine ng DNA, ang pag-ilaw ay tumaas nang malaki (20 beses pa). Ang kulay na inilabas nito ay maliwanag na asul. Kapansin-pansin, walang pagpapalabas ng fluorescence kapag nagbubuklod sa mga pares ng base ng GC (guanine-cytosine).

Mahalagang tandaan na kahit na mayroon din itong kaakibat para sa RNA, hindi ito nagiging sanhi ng isang problema, dahil ang pinakamataas na antas ng paglabas ng enerhiya mula sa molekula na ito ay nangyayari sa isa pang haba ng daluyong (500 nm), hindi katulad ng DNA, na ginagawa ito sa 460 nm. Bukod dito, ang pagtaas ng fluorescence sa sandaling nakasalalay sa RNA ay 20% lamang.

Ang DAPI ay higit na ginagamit upang mantsang patay (naayos) na mga cell kaysa sa mga live na cell, dahil ang isang mas mataas na konsentrasyon ng pangulay ay kinakailangan upang mantsang ang huli, ito ay dahil ang cell lamad ay mas mababa natatagusan sa DAPI kapag ito ay buhay.

Maaaring gamitin ang pangulay ng DAPI kasabay ng pula at berde na mga fluorophores para sa isang maraming kulay na karanasan.

Gumamit

Ang DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ay isang mahusay na fluorophore at samakatuwid ay malawakang ginagamit sa iba't ibang mga pamamaraan at para sa iba't ibang mga layunin. Ang sumusunod ay nagpapaliwanag sa paggamit ng DAPI sa pangunahing pamamaraan.

Daloy ng cytometry

Ang mga mananaliksik na Gohde, Schumann at Zante noong 1978 ay ang unang gumamit at nagmungkahi ng DAPI bilang isang fluorophore sa daloy ng diskarteng daloy, na mayroong mahusay na tagumpay dahil sa mataas na sensitivity sa DNA at ang mataas na intensity nito sa pagpapalabas ng fluorescence.

Ang paggamit ng DAPI sa pamamaraang ito ay nagbibigay-daan sa pag-aaral ng cell cycle, ang dami ng mga cell at paglamlam ng mga buhay at patay na mga cell.

Bagaman mayroong iba pang mga colorant, tulad ng ethidium bromide, Hoechst oxide, acridine orange at propidium iodide, ang DAPI ay isa sa mga pinaka-malawak na ginagamit dahil mas photostable ito kaysa sa naunang nabanggit.

Para sa pamamaraang ito ay kinakailangan upang ayusin ang mga cell, para dito, maaaring magamit ang ganap na ethanol o 4% paraformaldehyde. Ang sample ay sentripuged at ang supernatant ay itinapon, pagkatapos ay ang mga cell ay hydrated sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 5 ml ng PBS buffer sa loob ng 15 minuto.

Habang tumatagal ang oras, ihanda ang mantsa ng DAPI na may mantsa ng buffer (FOXP3 mula sa BioLegend) sa konsentrasyon ng 3 µM.

Isip ang halimbawang sample, itapon ang supernatant, at pagkatapos ay takpan ng 1 ml ng DAPI solution para sa 15 minuto sa temperatura ng silid.

Dalhin ang sample sa daloy ng cytometer na may naaangkop na laser.

Daloy Microfluorometry

Ang isa pang pamamaraan kung saan ginagamit ang DAPI ay sa daloy ng micro-fluorometry kasama ang isa pang fluorophore na tinatawag na mithramycin. Ang kapwa ay kapaki-pakinabang para sa pagkalkula ng chloroplast DNA nang paisa-isa, ngunit ang DAPI ay pinakaangkop para sa pagsukat ng mga particle ng bacteriophage ng T4.

Hybridization

Ang pamamaraan na ito ay karaniwang gumagamit ng mga probes ng DNA na may label na may fluorescent dye na maaaring maging DAPI.

Ang sample ay nangangailangan ng paggamot sa init upang ma-denature ang double-stranded DNA at i-convert ito sa dalawang stranded strand. Kasunod nito ang hybridized na may isang DAPI na may label na denatured na DNA probe na may pagkakasunod-sunod ng interes.

Nang maglaon ay hugasan upang maalis ang hindi na-hybridize, isang kaibahan ang ginamit upang mailarawan ang DNA. Ang mikroskop ng fluorescence ay nagbibigay-daan sa pag-obserba ng hybridized probe.

Ang pamamaraan na ito ay may layunin ng pag-alok ng mga tukoy na pagkakasunud-sunod sa chromosomal DNA, na nagawa ang pagsusuri ng ilang mga sakit.

Ang mga teknolohiyang cyto-molekular na ito ay malaking tulong sa pagtukoy ng mga detalye sa pag-aaral ng mga karyotypes. Halimbawa, ipinakita niya ang mga base na mayaman na mga rehiyon ng adenosine at thymine na tinatawag na heterochromatic na mga rehiyon o mga banda ng DAPI.

Ang teknolohiyang ito ay malawakang ginagamit para sa pag-aaral ng mga chromosome at chromatin sa mga halaman at hayop, pati na rin sa pagsusuri ng mga pathology ng prenatal at hematological sa mga tao.

Sa pamamaraang ito, ang inirekumendang konsentrasyon ng DAPI ay 150 ng / ml sa loob ng 15 minuto.

Ang mga natipon na slide ay dapat na maiimbak na protektado mula sa ilaw sa 2-8 ° C.

Immunofluorescence paglamlam

Ang mga cell ay naayos na may 4% paraformaldehyde. Kung ang iba pang mga mantsa ay gagamitin, ang DAPI ay naiwan sa dulo bilang isang counterstain at ang mga cell ay sakop ng PBS solution sa loob ng 15 minuto. Habang tumatagal ang oras, ihanda ang solusyon ng DAPI sa pamamagitan ng paglulunsad sa PBS, tulad na ang pangwakas na konsentrasyon ay 300 µM.

Pagkatapos ang labis na PBS ay tinanggal at natatakpan ng DAPI sa loob ng 5 minuto. Hugasan nang maraming beses. Ang slide ay tiningnan sa ilalim ng isang fluorescence mikroskopyo sa ilalim ng naaangkop na filter.

Kaligtasan sheet

Ang tambalang ito ay dapat hawakan nang may pag-aalaga, sapagkat ito ay isang tambalan na mayroong mga katangian ng mutagenic. Ang activate na carbon ay ginagamit upang maalis ang tambalang ito mula sa may tubig na mga solusyon na dapat itapon.

Ang mga guwantes, toga at baso ng kaligtasan ay dapat gamitin upang maiwasan ang mga aksidente sa reagent na ito. Kung nangyayari ang pakikipag-ugnay sa balat o mucosa, ang lugar ay dapat hugasan ng sapat na tubig.

Hindi ka dapat pipet ito reagent sa pamamagitan ng bibig, gumamit ng mga pipette.

Huwag mahawahan ang reagent sa mga ahente ng microbial dahil ito ay hahantong sa maling mga resulta.

Huwag palabnawin ang mantsa ng DAPI kaysa sa inirerekomenda, dahil makabuluhang bawasan nito ang kalidad ng mantsa.

Huwag ilantad ang reagent upang magdirekta ng ilaw, o panatilihing mainit-init habang binabawasan nito ang pag-ilaw.

Mga Sanggunian

1. Brammer S, Toniazzo C at Poersch L. Corantes na karaniwang kasangkot sa mga cytogenetics ng halaman. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Magagamit mula sa: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Magagamit sa: menarinidiagnostics.com/
3. Mga Cytocell Laboratories. 2019. Mga tagubilin para sa paggamit ng DAPI. magagamit sa cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Mga konsepto at pamamaraan sa ekolohiya ng ilog. (2009). Mga Rubial ng Editoryal, Espanya. Magagamit sa: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Ang paggamit ng fluorescence sa isang nabagong pamamaraan ng dissector upang matantya ang bilang ng mga myocytes sa cardiac tissue. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Magagamit mula sa: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Presensya ng phytoplasmas sa papaya (Carica papaya) sa Mexico. Chapingo Magazine. Serye ng hortikultura, 2011; 17 (1), 47-50. Magagamit sa: scielo.org.