RECOMBINANT DNA: DISKARTE, APLIKASYON AT BATAYAN - BIOLOGY - 2025

Ang recombinant DNA (rDNA o rDNA) ay isang artipisyal na molekula ng acid acid na nilikha sa laboratoryo, sa pamamagitan ng pagsasama ng dalawang mga segment ng mga organisasyong interes. Kilala rin ito bilang chimeric DNA, salamat sa hybrid na pag-aari nito. Ang ganitong uri ng DNA ay hindi matatagpuan sa kalikasan.

Ang pangunahing pamamaraan upang makabuo nito ay kinabibilangan ng: (a) ang pagpili ng isang target na DNA, at ang pagpasok nito sa isa pang fragment ng DNA (sa pangkalahatan ay isang bakterya na plasmid); (b) ang pagpapakilala ng plasmid na ito sa isang bakterya, (c) ang pagpili ng mga bakterya sa pamamagitan ng mga antibiotics at sa wakas (d) ang pagpapahayag ng gene.

Pinagmulan: pixabay.com

Sinasamantala ng pamamaraan ang isang hanay ng mga enzyme na posible upang kopyahin at i-paste ang mga tiyak na mga fragment ng DNA ayon sa paghuhukom ng mananaliksik.

Ang layunin ng teknolohiyang recombinant ay, sa karamihan ng mga kaso, ang pagpapahayag ng isang protina (na kilala bilang recombinant protein) na nais ng molekulang biologist para sa pananaliksik sa hinaharap o upang lumikha ng isang protina ng komersyal at therapeutic na halaga - tulad ng insulin ng tao, Halimbawa.

Ang mga pangunahing kaalaman sa pamamaraan ng recombinant na DNA at ang paggamit nito sa genetic engineering

Ang gitnang dogma ng molekular na biyolohiya

Ang lahat ng mga organikong nilalang na alam namin ay nagbabahagi ng maraming mga katangian. Ang isa sa mga ito ay ang likas na katangian ng genetic material at ang paraan ng paggawa ng mga protina - isang proseso na kilala bilang sentral na "dogma" ng molekula na molekula.

Maliban sa isang pares ng mga virus, ang lahat ng mga organismo ay nag-iimbak ng impormasyon sa genetic sa DNA (deoxyribonucleic acid), na nakolekta sa isang napaka-compact at organisadong paraan sa nucleus ng cell.

Para sa expression ng gene, ang molekula ng DNA ay isinalin sa messenger RNA, at ang huli ay isinalin sa wika ng mga amino acid, ang mga bloke ng gusali.

Ano ang isang recombinant DNA?

Sa pagitan ng 1970s at 1980s, nagsimulang samantalahin ng mga mololohikal na biolohiko ang mga proseso na natural na nangyayari sa loob ng cell at nagawa nilang i-extrapolate ang mga ito sa laboratoryo.

Sa ganitong paraan, ang isang gene ng pinagmulan ng hayop (isang vertebrate, halimbawa) ay maaaring maipasok sa isang segment ng DNA mula sa isang bakterya; o ang DNA ng isang bakterya ay maaaring pagsamahin sa isang virus na virus. Sa gayon, maaari naming tukuyin ang isang recombinant DNA bilang isang molekula na binubuo ng DNA mula sa dalawang magkakaibang mga organismo.

Kapag nilikha na ang hybrid o recombinant na molekula na ito, ipinahayag ang gene ng interes. Gamit ang salitang expression nais naming sumangguni sa proseso ng pagsasalin sa protina.

Mga paghihigpit sa mga enzyme at ligases: ang susi sa proseso

Ang isang pangunahing elemento sa pagbuo ng recombinant na teknolohiya ng DNA ay ang pagtuklas ng mga paghihigpit sa mga enzyme.

Ito ang mga molekula ng protina na nagpapakita ng kakayahang i-clear ang DNA (mga nucleases) sa mga tiyak na pagkakasunud-sunod, na nagsisilbing "molekulang gunting". Ang mga fragment na nabuo ng mga enzim na ito ay tinatawag na mga fragment ng paghihigpit.

Ang sinabi ng mga enzymes ay maaaring makagawa ng mga pagbawas ng simetriko sa pagkakasunud-sunod ng target (sa parehong mga tanikala sa parehong taas) o mga pagbawas ng simetriko. Ang isang pangunahing aspeto ng pagkilos ng mga paghihigpit sa mga enzymes ay pagkatapos ng pag-alis ng mga kadena, isang "maluwag na gilid" ay nakuha, pantulong sa iba pang mga gilid na pinutol ng parehong enzyme.

Ang ilang mga halimbawa ay ECOR 1 at Sma 1. Sa kasalukuyan higit sa 200 mga uri ng paghihigpit na mga enzymes ay kilala at magagamit sa komersyo.

Upang maging kapaki-pakinabang, ang isang gunting ay dapat na sinamahan ng pandikit. Ang pagkilos na ito ng pagbubuklod ng DNA (dati nang ginagamot sa mga paghihigpit na mga enzyme) ay isinasagawa ng mga ligases.

Teknolohiya: paano ang pagbabago ng DNA ng isang organismo na artipisyal na nabago sa laboratoryo?

Sa ibaba ay ilalarawan namin ang mga pangunahing hakbang na kinakailangan ng teknolohiyang recombinant na DNA. Ang lahat ay isinasagawa ng mga propesyonal sa isang molekular na biology laboratory.

Ano ang isang "clone"?

Bago magpatuloy sa pang-eksperimentong protocol, dapat nating tandaan na sa molekular na biology at biotechnology ang salitang "clone" at ang pandiwa na "clone" ay malawakang ginagamit. Ito ay maaaring humantong sa pagkalito.

Sa kontekstong ito, hindi namin tinutukoy ang pag-clone ng isang buong organismo (tulad ng sa kaso ng sikat na Dolly na tupa, halimbawa), ngunit sa pag-clone ng isang piraso ng DNA, na maaaring maging isang gene. Iyon ay, ang paggawa ng maraming kopya - genetically magkapareho - ng pagkakasunud-sunod.

1. Paghiwalay at pagkuha ng DNA

Ang unang hakbang ay ang magpasya kung aling pagkakasunod-sunod ang nais mong gamitin. Ito ay lubos na nakasalalay sa mananaliksik at mga layunin ng kanyang gawain. Ang DNA na ito ay dapat na ihiwalay at linisin. Ang mga pamamaraan at pamamaraan upang makamit ito ay nakasalalay sa katawan at tisyu.

Kadalasan, ang isang bahagi ng tisyu ay kinuha at napapailalim sa paggamot sa isang lysis buffer na may proteinase K (isang proteolytic enzyme) at pagkatapos ay makuha ang DNA. Kasunod nito, ang genetic na materyal ay nahati sa maliit na mga fragment.

2. Cloning vector

Matapos ang mga hakbang sa paghahanda, hinahanap ng mananaliksik na ipakilala ang segment ng interes ng DNA sa isang cloning vector. Mula ngayon tatawagin namin ang segment na ito ng puting DNA na DNA.

Plasmids

Ang isa sa mga ginagamit na vectors sa isang plasmid ng pinagmulan ng bakterya. Ang isang plasmid ay isang double-stranded, pabilog na molekula ng DNA na natural na matatagpuan sa bakterya. Ang mga ito ay dayuhan sa chromosome ng bakterya - iyon ay, sila ay extrachromosomal, at natagpuan nang natural sa mga prokaryote na ito.

Ang mga pangunahing elemento ng isang vector ay: (a) isang pinagmulan ng pagtitiklop, na nagpapahintulot sa synthesis ng DNA; (b) pagpili ng ahente, na ginagawang posible upang matukoy ang mga organismo na nagdadala ng plasmid na may target na DNA, tulad ng paglaban sa ilang antibiotic; at (c) site ng multicloning, kung saan matatagpuan ang mga pagkakasunud-sunod na makikilala ng mga paghihigpit na mga enzyme.

Ang unang matagumpay na recombinant na DNA sa laboratoryo ay na-clone sa plasmid pSC101 mula sa bacterium E. coli. Naglalaman ito ng isang site ng paghihigpit para sa paghihigpit ng enzyme EcoRI at isang gene para sa paglaban sa isang antibiotic, bilang karagdagan sa pinagmulan ng pagtitiklop.

Ang pagpasok ng target na DNA sa plasmid ay isinasagawa gamit ang mga molekular na tool ng paghihigpit ng mga enzymes at ligase na inilarawan sa nakaraang seksyon.

Ang natitirang mga uri ng vector

Bilang karagdagan sa mga plasmids, ang DNA ay maaaring maipasok sa iba pang mga vector, tulad ng bacteriophage lambda, kosmids, YACs (lebadyang artipisyal na kromosom), BACs (bacterial artipisyal na chromosome), at phagemids.

3. Panimula ng recombinant DNA

Kapag nakuha ang recombinant na molekula ng DNA (gene ng interes sa plasmid o iba pang vector), ipinakilala ito sa isang host o hostism na organismo, na maaaring maging isang bakterya.

Upang ipakilala ang dayuhang DNA sa isang bakterya, ginagamit ang isang pamamaraan na tinatawag na pagbabagong-anyo ng bakterya, kung saan ang organismo ay sumailalim sa isang paggamot na may mga divalent cations na ginagawang madaling kapitan sa pagkuha ng DNA.

Sa pamamaraan, hindi natin masiguro na 100% ng mga bakterya sa ating kultura ay epektibong kinuha ang aming recombinant DNA molekula. Narito kung saan ang bahagi ng plasmid na naglalaman ng resistensya ng antibiotic ay nagsisimula sa paglalaro.

Kaya, ang bakterya na kinuha ang plasmid ay magiging resistensya sa isang tiyak na antibiotic. Upang piliin ang mga ito, sapat na upang mag-aplay ang sinabi ng antibiotiko at kunin ang mga nakaligtas.

4. "Harvest" ang protina

Matapos piliin ang bakterya gamit ang aming recombinant DNA, nagpapatuloy kaming gumamit ng makina ng enzymatic ng host upang makabuo ng interes ng protina na produkto. Tulad ng pagpaparami ng bakterya, ang plasmid ay ipinasa sa kanilang mga supling, kaya hindi ito nawala sa panahon ng paghahati.

Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng bakterya bilang isang uri ng protina na "pabrika". Mamaya makikita natin na ito ay isang napaka-kaugnay na pamamaraan sa pag-unlad ng epektibong medikal na paggamot.

Kapag handa na ang kultura at ang bakterya ay gumawa ng maraming protina, ang selula ay nalugi o nagambala. Mayroong isang malawak na hanay ng mga biochemical na pamamaraan na pinapayagan ang paglilinis ng mga protina ayon sa kanilang mga katangian ng physicochemical.

Sa isa pang pang-eksperimentong konteksto, maaaring hindi tayo interesado na makabuo ng protina, ngunit sa halip ay interesado kaming makuha ang pagkakasunud-sunod ng DNA bawat se. Kung ganito ang kaso, ang plasmid ay gagamitin upang lumikha ng maraming mga kopya ng fragment ng interes upang magkaroon ng sapat na sa target na DNA upang maisagawa ang may-katuturang mga eksperimento.

Aplikasyon

Binuksan ng teknolohiya ng Recombinant DNA ang isang walang hanggan bilang ng mga posibilidad sa molekular na biology, biotechnology, gamot, at iba pang mga kaugnay na lugar. Ang mga pinaka-pambihirang aplikasyon ay ang mga sumusunod.

Pagsusuri ng genetic

Ang unang aplikasyon ay direktang nauugnay sa mga laboratoryo ng biology ng molekular. Ang teknolohiyang Recombinant na DNA ay nagbibigay-daan sa mga mananaliksik na maunawaan ang normal na pag-andar ng mga gene, at ang mga nabuo na protina ay maaaring magamit sa karagdagang pananaliksik.

Industriya ng parmasyutiko

Ang mga protina na ginawa gamit ang recombinant na pamamaraan ng DNA ay may mga aplikasyon sa gamot. Ang dalawang napaka-kaugnay na halimbawa sa larangan ay ang insulin ng tao at paglaki ng hormone, na inilalapat sa mga pasyente na kulang sa protina na ito.

Salamat sa recombinant DNA, ang mga protina na ito ay maaaring mabuo nang walang pangangailangan upang kunin ang mga ito mula sa ibang tao, na kumakatawan sa karagdagang mga komplikasyon sa pamamaraan at mga panganib sa kalusugan. Nakatulong ito na mapagbuti ang kalidad ng buhay para sa hindi mabilang na mga pasyente.

Mga Sanggunian

1. Magbasa, LEL, at Álvarez, CLC (2015). Talambuhay 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Ang cell: isang molekular na diskarte (Tomo 10). Washington, DC: pindutin ng ASM.
3. Devlin, TM (2004). Biochemistry: aklat-aralin na may mga klinikal na aplikasyon. Baligtad ko.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Papel ng Recombinant DNA Technology upang Mapagbuti ang Buhay. International journal ng genomics, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Ang anatomya ng pathological. Elsevier Spain.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Kaso, CL (2007). Panimula sa microbiology. Panamerican Medical Ed.
7. Ang, MJ (1989). Human insulin: Ang unang gamot sa teknolohiya ng DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.